一、恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答（论文文献综述）
王宁,赵鹏鹏,张艳艳,马勋,王正荣,薄新文[1]（2021）在《寄生虫DNA疫苗研究进展》文中研究指明寄生虫病带来了相当大的社会经济影响,人畜共患寄生虫给人们带来巨大的疾病负担,并给养殖业造成严重的经济损失。因此,寄生虫病的防治是人们迫切需要研究的课题。寄生虫存在很多形式的免疫逃避机制,灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等未达到理想的预防寄生虫病的效果,很多研究表明DNA疫苗有望成为预防和治疗寄生虫病的有效方法。DNA疫苗是一种新型疫苗,可同时诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫,通过在宿主内表达外源蛋白来提供保护性免疫。DNA疫苗与其他亚单位疫苗不同的是,免疫原由摄取抗原编码DNA的细胞在宿主内合成。体内蛋白质的合成也能进行抗原加工、修饰并递呈到宿主的免疫系统中,类似于自然感染的方式。笔者就DNA疫苗免疫机制、设计原则、免疫途径、优缺点及近几年寄生虫DNA疫苗的研究进展进行综述,以期为寄生虫DNA疫苗的开发提供理论参考。
刘冰,王奇,贺拥军,贺平[2]（2021）在《医学原虫相关蛋白的免疫调节作用研究进展》文中研究说明原虫是一类结构简单的单细胞真核生物,种类繁多,广泛分布于自然界。医学原虫可以寄生于人体的体液、组织或细胞等,通过多种有效机制调节宿主的免疫应答,逃避宿主免疫系统的攻击,使虫体在宿主体内生存繁殖并引起疾病。本文就疟原虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫和蓝氏贾第鞭毛虫相关蛋白的免疫调节作用进行综述,以期为防治医学原虫相关的寄生虫病提供资料。
赵宁宁[3]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中认为鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
刘亭岐[4]（2018）在《巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究》文中提出鸡球虫病是家禽的肠道胞内寄生原虫病。该病严重影响饲料转化效率,所以造成严重的损失。鸡球虫病目前基本通过使用化学药物进行预防治疗,然而,随着耐药性的产生和食品安全问题日益突出,有效的疫苗预防措施备受关注。本研究选取了四种巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）侵入过程相关的蛋白,进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在为发现新抗原以及评价其对宿主在抗巨型艾美耳球虫感染过程中所产生的免疫保护力,提供新型疫苗候选保护性抗原。1.巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的分子特性研究及免疫保护性研究评估本章研究成功扩增了E.maxima表面蛋白（EmSAG）的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由645对碱基所组成,编码214个氨基酸。随后,将EmSAG基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。激光共聚焦试验结果证实,EmSAG在巨型艾美耳球虫的子孢子表面分布,试验结果同时发现EmSAG也存在于裂殖子的表面。动物实验证实,rEmSAG和pVAX1-SAG都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmSAG疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmSAG免疫组中CD4+T和CD8+T细胞的百分含量均显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS,pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡血清中抗EmSAG特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-y与TGF-β含量显着增加（P<0.05）。本章研究结果表明,EmSAG可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供参考。2.巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima延伸因子2（elongation factor 2,EmEF2）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由2499对碱基组成,编码832个氨基酸。随后,将EmEF2基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmEF2和pVAX1-EF2都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmEF2疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmEF2免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡血清中抗EmEF2特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ,TGF-β含量显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmEF可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供备选抗原。3.巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima14-3-3基因（Em14-3-3）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由861bp对碱基组成,编码286个氨基酸。随后,将Em14-3-3基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。使用激光共聚焦试验对Em14-3-3进行亚细胞定位,试验结果表明Em14-3-3在巨型艾美耳球虫的子孢子和裂殖子阶段都有表达。动物试验证实,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。Em14-3-3疫苗可增加雏鸡的卵囊减少率,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组相比,Em14-3-3免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。与 PB S、pET-32a（+）和 pVAX 1 对照组雏鸡相比,rEm 14-3-3 和 pVAX 1-14-3-3免疫组的雏鸡,抗Em14-3-3特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ和TGF-β水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,Em14-3-3可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为新型巨型艾美耳球虫疫苗的研发打下基础。4.巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因分子特性及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima棒状蛋白（EmRON）的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由2475对碱基组成,编码824个氨基酸。随后,将EmRON基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmRON和pVAX1-RON都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmRON疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组雏鸡相比,EmRON免疫组中CD4+T细胞的的百分含量显着增高（P<0.05）。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,抗EmRON特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IFN-γ,TGF-β和IL-4水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmRON可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为巨型艾美耳球虫疫苗的研发提供候选抗原。
常建新[5]（2017）在《马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究》文中提出马流产沙门菌（Salmonella abortus equi）可引起马属动物的马流产沙门菌病,又名马副伤寒,其典型特征为孕马流产。随着新疆马匹养殖数量的增加,该病已严重危害马养殖业的发展。马鼻肺炎是由马疱疹病毒（Equine herpes virus,EHV）1型和4型引起的严重危害新疆养马业的重要传染病之一,马疱疹病毒1型可引起妊娠母马流产,流行较广泛,可造成严重经济损失。FliC是马流产沙门菌重要的鞭毛蛋白及分子佐剂。gD为马疱疹病毒免疫及保护的有效蛋白。为探讨鞭毛蛋白FliC对马疱疹病毒gD的分子佐剂效应,本研究对马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因进行融合表达并阐明FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果。本研究用PCR方法分别扩增FliC基因和gD基因的主要抗原表位,利用重叠延伸法将这2个基因进行融合,构建真核表达质粒pVAX1-FliC-gD,利用间接免疫荧光和western blotting鉴定重组蛋白的表达。将提取纯化的重组质粒免疫C57BL/6小鼠,并设pVAX1-gD、pVAX1-FliC、pVAX1和PBS为对照。第二次免疫后三周以1×105 PFU剂量的EHV-1-XJ2015滴鼻感染小鼠,并以马流产沙门菌最小致死量2×109 CFU/ml攻击小鼠。对免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、IFN-γ和IL-4的水平和肺组织病毒含量进行检测,并对肺组织病理学变化进行观察。结果表明成功构建了重组质粒pVAX1-FliC-gD、pVAX1-gD、pVAX1-FliC,经间接免疫荧光和western blotting鉴定该真核重组质粒可在体外表达。将提取纯化的重组质粒免疫C57BL/6小鼠,二免后抗体效价可达1:3200,融合表达质粒pVAX1-FliC-gD组小鼠血清中的总IgG1、IgG2a亚类和IFN-γ、IL-4水平均较pVAX1-gD免疫组、pVAX1-FliC免疫组显着增高（P<0.01）。马流产沙门菌攻击小鼠后,pVAX1-FliC-gD免疫组对小鼠的保护力为58.3%。荧光定量PCR法检测小鼠肺脏病毒DNA含量,结果表明攻毒后第5 d pVAX1及PBS免疫组病毒DNA含量最高,达到3.3×104 copies/μL,且pVAX1-FliC-gD免疫组、pVAX1-gD免疫组病毒DNA含量相对于pVAX1及PBS免疫组有明显减少（P<0.01）。组织病理学观察结果表明:pVAX1-FliC-gD免疫组、pVAX1-gD免疫组能有效限制马疱疹病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。上述结果显示FliC作为分子佐剂可显着增强马疱疹病毒gD基因的免疫效果,为马疱疹病毒新型疫苗的研究奠定了基础。
张德庆[6]（2011）在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中认为近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
刘栋[7]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究说明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
古小彬[8]（2009）在《兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究》文中研究表明兔疥螨病是家兔常见的多发性寄生虫病,具有高度接触性和传染性,能引起病兔发生剧痒及各种类型的皮炎,严重影响家兔的生长发育,降低皮毛质量,严重时可引起死亡,给养兔业造成巨大的经济损失。对该病病原的准确诊断是尽早对动物实施药物治疗、有效控制该病流行的关键。但长期以来,疥螨属内的螨虫虫种分类还是一个颇具争议的话题,疥螨的免疫机制也尚不清楚。目前,兔疥螨病防治仍以药物为主,尚无可用于免疫防制的疥螨疫苗。但药物长期使用不仅费用高,效果不理想,而且容易导致抗药虫株的出现和较严重的毒副作用,特别是药物在畜产品中的残留,通过食物链会对人体健康造成潜在威胁,有的甚至可能致癌。因此,本研究采用PCR技术扩增兔疥螨虫株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（COI）基因,并进行测序和序列分析;同时克隆兔疥螨的副肌球蛋白基因（Pmy）,构建该基因的原核表达载体和真核表达载体,对兔疥螨副肌球蛋白核酸疫苗、重组副肌球蛋白（PmyP）和疥螨全虫蛋白（ScTP）免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答进行分析,为解决兔疥螨虫株的分类地位和开发防治兔疥螨病的有效疫苗打下基础。主要研究工作和结果如下:1、采用PCR技术首次扩增了分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（COI）基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427 bp,序列间无插入、缺失,A+T含量（73%）明显高于G+C含量（27%）,碱基组成存在明显偏移。兔和猪的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高（99.1%～100.0%）,它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%～99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。2、首次扩增出兔疥螨副肌球蛋白基因的全序列,测序并进行了生物信息学分析。结果表明:兔疥螨副肌球蛋白基因全长2628bp,序列中A+T含量（58.1%）和G+C含量（41.9%）差异不明显;与已报道猪疥螨虫株、红狐疥螨虫株、大熊猫足螨、黑白花奶牛德州足螨、刺翼尘螨、热带无爪螨的副肌球蛋白基因的同源性分别为99.6%、99.5%、83.0%、82.6%、82.1%和82.0%,推导的氨基酸同源性分别为100.0%、97.6%、97.6%、94.4%、97.1%和95.2%。兔疥螨副肌球蛋白基因共编码875个氨基酸,以Glu、Leu和Gln的含量最高,Cys、Pro和Trp的含量最低:副肌球蛋白分子理论值为102.36 kDa,理论pI=5.59,带负电荷,无信号肽,无跨膜区,含有大量的亲水性区域,共有4个潜在的N-糖基化位点;其二级结构中含96.91%的α-螺旋,0.11%的β-转角,2.86%不规则盘绕。3、将构建的原核表达质粒pET32a-Pmy转化表达宿主菌BL21（DE3）进行原核表达,同时对表达条件进行优化,确立了pET32a-Pmy表达的最佳条件为37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导6 h,融合表达的副肌球蛋白分子量为124.36 kDa,并以不溶的包涵体形式存在于菌体中:免疫印迹发现该表达蛋白能与疥螨病患兔血清相识别。将构建的真核表达载体pVAX1-Pmy转染COS-7细胞,通过RT-PCR及间接免疫荧光检测,表明pVAX1-Pmy真核表达质粒在COS-7细胞中得到正常转录与表达。4、将构建的兔疥螨副肌球蛋白DNA疫苗pVAX1-Pmy以100μg/只剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔2周。一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、49 d、63 d、77 d及105 d采集小鼠的抗凝血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脑组织,提取血液和各组织DNA进行PCR扩增。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到小鼠细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明:一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及49 d能在小鼠血液及各检测的组织器官检测到该质粒;一免后63 d,除脑组织外,其余各组织器官及血液中均有质粒的分布:一免后77d,只在血液、肌肉和心脏中检测到质粒;一免后105 d仅在注射部位的肌肉中检测到该质粒。纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合情况,证实该DNA疫苗安全性好。5、pMD18-T-IL-2、pMD18-T-IL-4、pMD18-T-IFN-γ质粒分别经BamHⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+HindⅢ酶切后,与经相同限制性内切酶处理的pVAX1质粒,经胶回收后,连接、转化入DH5α。扩大培养后小量抽提质粒,经PCR和双酶切鉴定正确,表明成功构建了pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4和pVAX1-IFN-γ真核表达质粒。6、将120只BALB/c小鼠随机分成对照组（PBS组、pVAX1组）、DNA疫苗免疫组（Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组）、蛋白疫苗免疫组[兔疥螨全虫蛋白组（ScTP组）和重组副肌球蛋白组（PmyP组）]（共8组）。PBS组:肌肉注射PBS液100μL;pVAX1组:肌肉注射pVAX1质粒100μg;Pmy组:肌肉注射pVAX1-Pmy质粒100μg;Pmy+IL-2组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-2各100μg;Pmy+IL-4组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-4各100μg;Pmy+IFN组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IFN-γ各100μg;PmyP组:皮下注射重组副肌球蛋白50μg:ScTP组:皮下注射兔疥螨全虫蛋白50μg。共免疫3次,每次间隔2周,检测小鼠的抗体水平（IgG、IgG1、IgG2a、IgE、IgM）、淋巴细胞增殖能力、脾细胞悬液分泌的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ）含量及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。ELISA检测小鼠血清中的抗体结果显示:ScTP组和PmyP组小鼠的IgG、IgG1抗体水平高于DNA疫苗组,但这两个组小鼠的IgG2a水平低于DNA疫苗组;一免后14d～42d,Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠的IgG水平高于Pmy组;Pmy+IL-4组产生IgG1的水平高于Pmy组,除免疫后14 d,其余检测时间内均差异显着（P＜0.05）;Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠的IgG2a水平高于Pmy组,免疫后14 d～35 d,Pmy+IL-2组与Pmy组的差异显着（P＜0.05）;Pmy+IL-4组产生的IgE水平高于其他免疫组,免疫后14 d,差异显着（P＜0.05）;ScTP组和PmyP组产生的IgM水平高于各DNA疫苗组,免疫后7 d～35 d,与Pmy组差异显着（P＜0.05）:免疫后21 d～42 d,Pmy+IL-2组小鼠的IgM值高于Pmy组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组,但差异不显着（P＞0.05）。脾淋巴细胞增殖结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组刺激指数明显高于pVAX1组刺激指数（P＜0.05）,且DNA疫苗组的增殖能力大于蛋白疫苗组。脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果显示:Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-2含量显着高于其他免疫组（P＜0.05）,它们分泌的IFN-γ显着高于Pmy+IL-4组、ScTP组及PmyP组（P＜0.05）,但这两组的小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4显着低于其他疫苗免疫组（P＜0.05）;Pmy+IL-4组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4、IL-5显着高于其他疫苗免疫组（P＜0.05）。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠外周血CD4+、CD8+T数量明显高于空载体组（P＜0.05）。从检测分析结果来看,疥螨全虫蛋白和重组副肌球蛋白免疫小鼠主要引起小鼠的Th2免疫应答;而pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-2和pVAX1-Pmy+pVAX1-IFN-γ免疫小鼠后主要引起小鼠的Th1型免疫应答:pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-4则主要引起小鼠的Th2型免疫应答;且疫苗免疫各组小鼠的T淋巴细胞均进行了有效增殖。本研究对兔疥螨全虫疫苗、兔疥螨重组副肌球蛋白疫苗及副肌球蛋白核酸疫苗的免疫应答进行了评价,为研制高效的兔疥螨疫苗奠定了基础。
田浪[9]（2009）在《禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究》文中指出禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位（主要是中和抗原表位）和T细胞表位（主要是CTL抗原表位）,同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7（S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA）。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列,3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）,转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗（HRP标记兔抗鸡IgG）最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高（血清稀释度可达1∶300）、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利（专利授权号为200410081443.4）的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显着（P＜0.05）。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显着（P＜0.05）。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗（75%）。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗（75%）;与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。
薛春林[10]（2006）在《分子佐剂对生长抑素基因免疫的作用及其机制研究》文中认为以生长抑素基因（SS）与乙肝表面抗原（HBsAg，S）基因融合的真核表达质粒pES／2SS为基础，制备S／2SS与GM-CSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒及细菌DNA等，免疫小鼠及湖羊，探讨影响生长抑素基因疫苗免疫应答及促生长效果的因素，了解生长抑素基因免疫动物的作用机制，建立合适的生长抑素基因免疫程序，为最终获得经济有效的生长抑素基因免疫方法和疫苗、开发促生长、提高畜牧生产效率的新技术奠定基础。 1．S／2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建 ①pES／2SS-GMCSF表达产物抗原表位预测 应用DNA软件分析质粒pES／2SS-GMCSF及pES／2SS融合基因表达产物的结构和理化特性，发现二者S／2SS区域抗原表位一致。同样，在插入生长抑素氨基酸序列的2个区域存在抗原表位。在pES／2SS-GMCSF质粒中，S／2SS区域以外有另外的抗原表位区，推测GMCSF不改变S／SS表达产物抗原表位，且能够增强生长抑素免疫学活性。 ②S／2SS与GMCSF基因的融合表达质粒和基因佐剂质粒的构建及鉴定 酶切pCS／2SS-GMCSF质粒获得GMCSF小片段，插入到pES／2SS（有终止密码子）和pEGS／2SS（无终止密码子，能表达GFP蛋白）大片段中，构建pES／2SS-GMCSF和pEGS／2SS-GMCSF；以pEGFP-N1为质粒载体，类似方法酶切pCGMCSF质粒得到GMCSF小片段，合成CpG基因退火成双链，构建成pE-GMCSF和pE-CpG基因佐剂质粒；酶切、测序鉴定表明，基因的插入位点、方向、序列完全正确。采用脂质体包裹法将重组表达质粒转染COS细胞使其表达，用间接ELISA或荧光显微镜对其表达产物进行检测。结果表明，pEGS／2SS-GMCSF转染72h后的COS细胞检出强烈荧光。ELISA结果显示，质粒表达的融合蛋白均具有SS的免疫学活性，表明融合表达质粒均可在哺乳动物细胞中表达具有生长抑素免疫学活性的融合蛋白，而表达水平pEGS／2SS＜pES／2SS＜pEGS／2SS-GMCSF＜pES／2SS-GMCSF，提示pEGS／2SS-GMCSF、pES／2SS-GMCSF可能具有较好的免疫效果。 2 CpGDNA系列佐剂对生长抑素DNA疫苗（pES／2SS）免疫小鼠的免疫增强作用 选择60只20日龄ICI小鼠，雌雄各半，分为6组，分别用CpG-ODN（单链CpG）、pE-CDG质粒、E.coli DNA（细菌DNA）、脂质体粗品等佐剂联合生长抑素质粒pES／2SS进行免疫。疫苗剂量为20μg／只，佐剂按等量与之混合。初次免疫2周后以相同剂量
二、恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答（论文提纲范文）
（1）寄生虫DNA疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 DNA疫苗作用机制及设计原则 |
| 1.1 作用机制 |
| 1.2 DNA疫苗的设计原则 |
| 2 DNA疫苗免疫方式 |
| 2.1 EP |
| 2.2 PMEd |
| 2.3 脂质体 |
| 2.4 微米和纳米颗粒 |
| 3 DNA疫苗优缺点 |
| 3.1 DNA疫苗优点 |
| 3.1.1 同时引起体液免疫和细胞免疫 |
| 3.1.2 表达的蛋白质类似天然真核生物结构并伴随翻译后修饰 |
| 3.1.3 MHCⅠ类和Ⅱ类分子均递呈抗原，具有极化T细胞的能力 |
| 3.1.4 免疫原性的长期持久性 |
| 3.1.5 DNA疫苗其他优点 |
| 3.2 DNA疫苗缺点 |
| 4 寄生虫DNA疫苗 |
| 4.1 原虫DNA疫苗 |
| 4.1.1 疟原虫 |
| 4.1.2 新孢子虫 |
| 4.1.3 贝氏隐孢子虫 |
| 4.1.4 弓形虫 |
| 4.1.5 利什曼原虫 |
| 4.1.6 克氏锥虫 |
| 4.1.7 球虫 |
| 4.2 蠕虫DNA疫苗 |
| 4.2.1 吸虫 |
| 4.2.2 线虫 |
| 4.2.3 绦虫 |
| 5 展 望 |
（2）医学原虫相关蛋白的免疫调节作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 疟原虫相关蛋白 |
| 1.1 恶性疟原虫红细胞膜蛋白1 (P.falciparumerythrocyte membrane protein 1,Pf EMP1) |
| 1.2 恶性疟原虫网织红细胞结合蛋白同系物家族（P.falciparum reticulocyte-binding protein homologue,Pf Rh）和红细胞结合样蛋白（erythrocytebinding-like protein,EBL) |
| 1.3 环子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP) |
| 1.4 裂殖子表面蛋白（merozoite surface protein,MSP) |
| 1.5 重复散布家族（repetitive interspersed familiesof polypeptide,RIFIN) |
| 1.6 亚基因组变异开放阅读框（subtelomeric vari ant open reading frame,STEVOR）基因编码蛋白 |
| 2 弓形虫相关蛋白 |
| 2.1 弓形虫热激蛋白70 (T.gondii heat shockprotein 70,Tg HSP70) |
| 2.2 缓殖子抗原1 (bradyzoite antigen 1,BAG1) |
| 2.3 MIC3 |
| 2.4 棒状体蛋白16 (rhoptry protein 16,ROP16) |
| 2.5 ROP18 |
| 2.6 表膜抗原1 (surface antigen 1,SAG1) |
| 3 杜氏利什曼原虫相关蛋白 |
| 3.1 杜氏利什曼原虫胞浆蛋白 |
| 3.2 无鞭毛体蛋白 |
| 4 蓝氏贾第鞭毛虫相关蛋白 |
| 5 结语 |
（3）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（4）巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 巨型艾美耳球虫的危害及防控现状 |
| 1 巨型艾美耳球虫(Eimeria. maxima)生活史 |
| 2 巨型艾美耳球虫的流行情况 |
| 3 巨型艾美耳球虫病的症状及病理变化 |
| 4 鸡球虫病的防治现状 |
| 5 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 巨型艾美耳球虫4种侵入相关抗原研究进展 |
| 1 鸡艾美耳球虫表面蛋白 |
| 2 鸡艾美耳球虫延伸因子2 |
| 3 鸡艾美耳球虫14-3-3蛋白 |
| 4 鸡艾美耳球虫棒状体蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmSAG基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmSAG基因的克隆结果 |
| 2.3 重组质粒pMD19-T-SAG的鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒pET-32a(+)-SAG的构建和鉴定 |
| 2.5 重组SAG蛋白的诱导表达以及纯化 |
| 2.6 Wester blot分析 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-EmSAG的构建和鉴定 |
| 2.8 DNA疫苗pVAX-EmSAG在鸡体内表达的检测 |
| 2.9 EmSAG蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.10 EmSAG基因免疫保护试验结果 |
| 2.11 EmSAG免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.12 EmSAG免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.13 EmSAG免疫诱导鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文章 |
| 第四章 巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmEF2基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmEF2基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-EF2的构建和鉴定 |
| 2.4 重组EF2蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-EmEF2的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmEF2在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmEF2免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmEF2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏T淋巴细胞亚群变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em14-3-3基因的生物信息学分析 |
| 2.2 14-3-3 PCR扩增和克隆 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-14-3-3的构建 |
| 2.4 重组14-3-3蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 Em14-3-3蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.9 Em14-3-3的免疫保护试验结果 |
| 2.10 Em14-3-3免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.11 Em14-3-3免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.12 Em14-3-3刺激鸡脾脏T淋巴细胞百分含量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmRON基因的克隆和序列分析 |
| 2.2 EmRON基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-RON的构建和鉴定 |
| 2.4 重组RON蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX-EmRON的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmRON在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmRON免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmRON免疫诱导血清抗体和细胞因子 |
| 2.10 鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表情况 |
| 致谢 |
（5）马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 马疱疹病毒概述 |
| 1.2 马疱疹病毒形态、基因组结构及主要结构蛋白和功能 |
| 1.3 马疱疹病毒gD基因研究进展 |
| 1.4 马鼻肺炎的防控 |
| 1.5 佐剂及其作用机理 |
| 1.6 佐剂分类 |
| 1.7 马流产沙门菌病概述 |
| 1.8 沙门菌鞭毛蛋白及其作为分子佐剂的研究 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第2章 pVAX1-FliC、pVAX1-gD、pVAX1-FliC-gD 真核表达载体的构建与表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 马流产沙门菌融合鞭毛蛋白FliC增强马疱疹病毒gD质粒DNA免疫效果的分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 核酸疫苗的构成 |
| 1.1.1.1 抗原编码基因 |
| 1.1.1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.1.2 核酸疫苗的分类 |
| 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制 |
| 1.1.4 核酸疫苗的免疫 |
| 1.1.4.1 靶细胞的选择 |
| 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理 |
| 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量 |
| 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择 |
| 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂 |
| 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂 |
| 1.1.4.5.3 补体佐剂 |
| 1.1.4.5.4 免疫刺激序列( |
| 1.1.4.5.5 霍乱毒素(choleratoxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素( |
| 1.1.4.5.6 蛋白转换域( |
| 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用 |
| 1.1.5 核酸疫苗的应用 |
| 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗 |
| 1.1.5.2 细菌核酸疫苗 |
| 1.1.5.3 病毒核酸疫苗 |
| 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望 |
| 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展 |
| 1.2.1 补体系统的组成 |
| 1.2.1.1 补体固有成分 |
| 1.2.1.2 补体调节蛋白 |
| 1.2.1.3 补体受体 |
| 1.2.2 补体的激活 |
| 1.2.2.1 经典激活途径 |
| 1.2.2.2 旁路途径 |
| 1.2.2.3 凝集素途径 |
| 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1.2.3.1 C3d 的产生 |
| 1.2.3.2 C3d 的分子结构 |
| 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2 |
| 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点 |
| 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法 |
| 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联 |
| 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联 |
| 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用 |
| 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响 |
| 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响 |
| 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响 |
| 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用 |
| 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响 |
| 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈 |
| 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟 |
| 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达 |
| 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| 1.2.7 不同动物C3d 的研究 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性 |
| 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构 |
| 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质 |
| 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构 |
| 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白 |
| 1.3.2 PRRSV 的免疫特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展 |
| 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4.2 抗原检测方法 |
| 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断 |
| 1.3.4.4 血清学诊断 |
| 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展 |
| 1.3.5.1 核酸疫苗 |
| 1.3.5.2 重组多肽疫苗 |
| 1.3.5.3 活载体疫苗 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液及配制 |
| 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆 |
| 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建 |
| 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序 |
| 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析 |
| 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n(n=2，4，6)的构建 |
| 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增 |
| 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.3.3 数据处理和分析 |
| 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建 |
| 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.4.4 数据处理和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果 |
| 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列 |
| 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析 |
| 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆 |
| 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 3.3.1 GP5 表达结果 |
| 3.3.2 安全性检验结果 |
| 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.3.3.1 抗体水平检测结果 |
| 3.3.3.2 中和抗体测定结果 |
| 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果 |
| 3.3.3.4 IL-4 含量的测定 |
| 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 invH 表达结果 |
| 3.4.3 安全性检验结果 |
| 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.4.4.1 invH 抗体水平结果 |
| 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量 |
| 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆 |
| 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建 |
| 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义 |
| 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（7）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（8）兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 疥螨与疥螨病研究进展 |
| 1 病原形态与分类 |
| 1.1 病原形态 |
| 1.2 分类 |
| 2 生物学特性 |
| 2.1 生活史 |
| 2.2 生活习性 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 宿主 |
| 3.2 感染与流行 |
| 3.3 疥螨病流行的促进因素 |
| 4 临床症状 |
| 5 病理学变化 |
| 5.1 组织病理学变化 |
| 5.2 血液病理学变化 |
| 6 致病过程及机理 |
| 7 免疫学 |
| 7.1 抗原研究 |
| 7.2 疥螨引起的免疫应答 |
| 8 疥螨的分子生物学 |
| 8.1 疥螨的遗传学研究 |
| 8.2 疥螨cDNA文库的构建 |
| 8.3 疥螨表达序列标签(EST)分析 |
| 9 诊断 |
| 9.1 病原学诊断 |
| 9.2 免疫学诊断 |
| 9.2.1 血凝抑制实验 |
| 9.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 9.2.3 聚合酶链反应(PCR) |
| 10 治疗 |
| 11 展望 |
| 二 寄生虫核酸疫苗研究进展 |
| 1 原虫核酸疫苗 |
| 1.1 疟疾 |
| 1.2 利什曼原虫病(Leishmaniosis) |
| 1.3 隐孢子虫病(Cryptosporidiosis) |
| 1.4 弓形虫病(Toxoplasmosis) |
| 1.5 球虫病(Coccidiosis) |
| 1.6 泰勒虫病 |
| 2 蠕虫核酸疫苗 |
| 2.1 血吸虫病(Schistosomiosis) |
| 2.1.1 脂肪酸结合蛋白(FABP) |
| 2.1.2 代谢酶类基因片段 |
| 2.2 囊尾蚴病(Cysticercosis) |
| 2.3 旋毛虫病(Trichinellosis) |
| 2.4 捻转血矛线虫病 |
| 3 节肢昆虫核酸疫苗 |
| 4 寄生虫核酸疫苗的展望 |
| 三 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 基于线粒体细胞色素氧化酶I(COI)序列的兔和猪四个疥螨分离株的系统发育关系分析 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体、工具酶和主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 培养基及常用液体的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 疥螨虫体的采集 |
| 1.2.2 疥螨虫体基因组DNA的提取 |
| 1.2.3 引物的设计 |
| 1.2.4 PCR的反应体系和条件 |
| 1.2.5 PCR产物的纯化 |
| 1.2.6 序列分析与系统树的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 4个疥螨分离株COI基因序列变异及组成 |
| 2.2 疥螨分离株的COI基因序列同源性分析 |
| 2.3 基于疥螨COI基因构建分子系统树 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA提取 |
| 3.2 线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因的选择 |
| 3.3 基因序列组成特征 |
| 3.4 密码子不同位点碱基组成特征 |
| 3.5 氨基酸组成和密码子使用特征 |
| 3.6 疥螨属内的系统发生关系研究 |
| 3.6.1 目前采用传统分类方法对疥螨属内的种级分类尚存一定争议 |
| 3.6.2 分子标记基因已广泛应用于疥螨属内螨虫的分类学研究中 |
| 3.6.3 在分子系统学研究中,物种分类地位的确定依据 |
| 4 小结 |
| 第二章 兔疥螨副肌球蛋白基因的扩增及序列分析 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 兔疥螨虫株来源 |
| 1.1.2 载体、菌株、工具酶和主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 培养基及常用液体的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 兔疥螨总RNA的提取 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 RT-PCR扩增体系与反应条件 |
| 1.2.4 PCR产物回收与连接 |
| 1.2.5 转化 |
| 1.2.6 重组质粒DNA的小量制备 |
| 1.2.7 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 |
| 1.2.8 兔疥螨副肌球蛋白基因的生物信息学预测 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔疥螨副肌球蛋白基因的RT-PCR扩增与重组质粒pMD18-T-Pmy鉴定 |
| 2.2 副肌球蛋白基因的序列测定、碱基组成及同源性分析 |
| 2.2.1 疥螨虫株副肌球蛋白全基因的碱基组成分析 |
| 2.2.2 GenBank中报道的螨类副肌球蛋白基因及推导的氨基酸同源性分析 |
| 2.2.3 副肌球蛋白基因的系统树构建 |
| 2.3 兔疥螨副肌球蛋白的生物信息学分析 |
| 2.3.1 副肌球蛋白基因密码子偏向性分析 |
| 2.3.2 兔疥螨副肌球蛋白的氨基酸分析 |
| 2.3.3 兔疥螨副肌球蛋白的二级结构预测分析 |
| 2.3.4 兔疥螨副肌球蛋白的疏水性预测 |
| 2.3.5 兔疥螨副肌球蛋白的跨膜区分析 |
| 2.3.6 兔疥螨副肌球蛋白的糖基化位点预测 |
| 2.3.7 兔疥螨副肌球蛋白的信号肽位点预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 兔疥螨虫株副肌球蛋白密码子偏向性分析 |
| 3.2 GenBank中登录的疥螨虫株副肌球蛋白基因间的比较 |
| 3.3 基于副肌球蛋白基因进行各物种系统发育关系分析 |
| 3.4 兔疥螨副肌球蛋白基因的特性 |
| 4 小结 |
| 第三章 兔疥螨副肌球蛋白基因的原核和真核表达 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 工具酶和主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 培养基和常用溶液的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 pET32a-Pmy原核表达载体的构建及表达 |
| 1.2.2 pVAX1-Pmy重组真核表达载体的构建及表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 pET32a-Pmy在大肠杆菌中的原核表达 |
| 2.1.1 pET32a-Pmy的PCR鉴定和酶切鉴定 |
| 2.1.2 重组pET32a-Pmy表达质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组质粒表达条件的优化 |
| 2.1.4 融合蛋白表达产物Western-Blotting检测 |
| 2.2 Pmy-pVAX1在COS-7细胞中的真核表达 |
| 2.2.1 真核表达载体pVAX1-Pmy的PCR和酶切鉴定 |
| 2.2.2 脂质体转染和RT-PCR检测基因转录 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 副肌球蛋白的分布和特征 |
| 3.2 原核表达系统 |
| 3.2.1 原核表达载体的选择 |
| 3.2.2 原核表达条件的优化 |
| 3.2.3 目的蛋白在大肠杆菌中的表达形式 |
| 3.2.4 包涵体的纯化及目的蛋白的回收 |
| 3.3 真核表达系统 |
| 3.3.1 pVAX1特性 |
| 3.3.2 关于转染的影响因素 |
| 3.3.3 转染细胞的选择 |
| 3.3.4 目的抗原的检测 |
| 4 小结 |
| 第四章 pVAX1-Pmy真核质粒在小鼠体内的动态分布和安全性研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 常用液体配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Pmy-pVAX1质粒的大量制备及纯化 |
| 1.2.2 核酸疫苗在小鼠体内的动态分布 |
| 2 结果 |
| 2.1 Pmy-pVAX1质粒在小鼠体内的动态分布 |
| 2.2 质粒的安全性检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA疫苗的分布 |
| 3.2 DNA疫苗的安全性 |
| 4 小结 |
| 第五章 兔γ-干扰素(γ-IFN)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-4(IL-4)真核表达质粒的构建 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体、质粒和菌株 |
| 1.1.2 工具酶和主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 培养基及常用液体的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 双酶切反应 |
| 1.2.2 酶切产物与载体的连接 |
| 1.2.3 转化感受态细胞 |
| 1.2.4 重组质粒的提取 |
| 1.2.5 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔IL-2、IL-4和γ-IFN基因片段的获取 |
| 2.2 pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4和pVAX1-IFN-γ酶切鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 构建三种细胞因子真核表达载体的意义 |
| 3.2 兔IL-2、IL-4和γ-IFN基因的获得 |
| 4 小结 |
| 第六章 副肌球蛋白核酸疫苗及蛋白疫苗的小鼠免疫研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 质粒、菌株和细胞 |
| 1.1.3 工具酶和主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 培养基及常用液体的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 核酸疫苗和蛋白疫苗的准备 |
| 1.2.2 小鼠的免疫 |
| 1.2.3 样品的采集 |
| 1.2.4 基因免疫小鼠体液免疫水平的检测 |
| 1.2.5 基因免疫小鼠细胞免疫水平的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫前后小鼠血清抗体的ELISA检测结果 |
| 2.1.1 小鼠血清中IgG的检测结果 |
| 2.1.2 小鼠血清中IgG1的检测结果 |
| 2.1.3 小鼠血清中IgG2a的检测结果 |
| 2.1.4 小鼠血清中IgE的检测结果 |
| 2.1.5 小鼠血清中IgM的检测结果 |
| 2.2 小鼠的淋巴细胞转化检测结果 |
| 2.3 小鼠脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果 |
| 2.3.1 IL-2、IL-4、IL-5及γ-IFN标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 细胞因子检测结果 |
| 2.4 小鼠外周血CD4~+、CD8~+T细胞数量的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于DAN疫苗的免疫途径 |
| 3.2 关于基因疫苗诱导机体产生特异性免疫的机制 |
| 3.3 宿主感染疥螨后的免疫应答特征 |
| 3.4 核酸疫苗和蛋白疫苗的免疫效果 |
| 3.4.1 抗体的检测 |
| 3.4.2 淋巴细胞增殖能力的检测 |
| 3.4.3 细胞因子的检测 |
| 3.4.4 流式检测结果 |
| 4 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 选题背景 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 3.多表位DNA疫苗的研究概况 |
| 4.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 5.细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 本研究前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的内容及目的意义 |
| 本研究的技术路线 |
| 第一章 禽传染性支气管炎病毒S1、S2、N蛋白抗原表位预测筛选及多表位嵌合基因克隆 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 数据库、生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.3 工具酶及试剂及主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的预测分析 |
| 2.2.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的确定 |
| 2.2.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因的获取 |
| 2.2.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接 |
| 2.2.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的克隆及鉴定 |
| 2.2.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV S1、S2、N蛋白B细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.2 IBV S1、S2、N蛋白T细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因片段的选择及合成 |
| 3.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接结果 |
| 3.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的鉴定结果 |
| 3.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的结构特征分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于IBV的免疫机理 |
| 4.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的分析及选择 |
| 4.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位的获取及嵌合基因的拼接 |
| 4.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的构建策略 |
| 4.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学特征 |
| 5.小结 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因原核表达及ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 IBV多表位嵌合基因的原核诱导表达 |
| 2.2.3 IBV多表位嵌合基因原核表达产物的鉴定 |
| 2.2.4 IBV多表位嵌合基因原核表达条件的优化 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体pET-32a-F的鉴定 |
| 3.2 IBV多表位嵌合基因表达产物的SDS-PAGE及Western blots |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因原核表达诱导时间、浓度、温度的筛选 |
| 3.4 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布及纯化 |
| 3.5 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 4.讨论 |
| 4.1 IBV多表位嵌合蛋白的表达系统 |
| 4.2 IBV多表位嵌合蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 IBV多表位嵌合蛋白的回收及活性 |
| 4.4 关于IBV多表位嵌合蛋白的间接ELISA方法 |
| 5.小结 |
| 第三章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗构建及真核表达检测 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 鸡白介素IL-1β/2/18真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-18质粒的鉴定 |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因及鸡白介素真核表达转录产物RT-PCR检测 |
| 3.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒表达产物的间接免疫荧光检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于多表位DNA疫苗 |
| 4.2 不同载体于体外表达IBV多表位嵌合基因 |
| 4.3 关于IBV多表位嵌合基因真核表达质粒的体外转染 |
| 4.4 影响外源基因表达的因素 |
| 4.5 IBV结构蛋白多表位嵌合基因的体外表达的检测 |
| 5.小结 |
| 第四章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗配制和免疫研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测 |
| 2.2.3 DNA疫苗的配制 |
| 2.2.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F、pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗免疫组的攻毒保护性实验 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.2 脂质体的转染效率检测 |
| 3.3 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.3.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.4 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.4.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.5 攻毒实验结果 |
| 3.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 DNA疫苗的配制和免疫 |
| 4.2 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.3 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.4 关于攻毒保护性试验 |
| 4.5 关于DNA疫苗的分布和整合可能性 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展 |
| 3.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 4.多表位疫苗的研究概况 |
| 5.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 6.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 7.DNA疫苗的组织分布 |
| 8.DNA疫苗的整合可能性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:英汉缩略名词对照表 |
| 在读博士期间发表的论文情况 |
（10）分子佐剂对生长抑素基因免疫的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 生长抑素在动物生产中的作用及其免疫调控 |
| 1 生长抑素 |
| 1.1 生长抑素的生物学特性及其生理作用 |
| 1.1.1 生长抑素的分子结构 |
| 1.1.2 生长抑素的分布及其生理作用 |
| 1.2 生长抑素受体 |
| 1.3 生长抑素体内作用机制 |
| 2 生长激素分泌的神经内分泌调节 |
| 3 激素免疫调控研究的概述 |
| 3.1 生长激素轴的免疫调控 |
| 3.2 GRF的免疫调控 |
| 3.3 类胰岛素生长因子作用的调节 |
| 3.4 动物生长抑素的调控研究 |
| 3.4.1 生长抑素主动免疫 |
| 3.4.1.1 生长抑素合成肽疫苗促生长的研究 |
| 3.4.1.2 生长抑素基因工程苗促生长的研究 |
| 3.4.1.3 SS痘苗病毒活载体苗的研究 |
| 3.4.2 生长抑素被动免疫 |
| 第二章.生长抑素基因免疫技术和分子佐剂研究进展 |
| 1 生长抑素基因疫苗的构建 |
| 1.1 生长抑素抗原基因的优化和免疫增强基因的选择 |
| 1.2 真核表达载体的选择 |
| 1.3 生长抑素基因疫苗的表达鉴定 |
| 1.4 生长抑素基因疫苗pES／2SS的构建 |
| 2.分子佐剂研究进展 |
| 2.1.CpG免疫刺激寡核苷酸序列 |
| 2.2 细胞因子 |
| 2.3 编码共刺激信号分子的重组质粒 |
| 2.4.阳离子脂质体 |
| 2.5 其它佐剂 |
| 3 提高生长抑素基因免疫效果的主要途径 |
| 3.1 细胞因子或化学因子的协同 |
| 3.2 免疫佐剂 |
| 3.3 DNA疫苗接种方法的选择 |
| 3.4 改变DNA疫苗的细胞定位 |
| 3.5 异源初始-加强免疫 |
| 3.6 母源抗体 |
| 3.7 多表位基因疫苗 |
| 4 生长抑素基因免疫对动物生长的作用及其机制 |
| 4.1 生长抑素基因免疫的作用机制 |
| 4.2 生长抑素基因免疫 |
| 5 基因免疫可能存在的问题 |
| 5.1 DNA疫苗安全性问题 |
| 5.2 关于免疫效果相差较大的问题 |
| 5.3 关于启动子的选择问题 |
| 5.4 关于蛋白质、内毒素的污染问题 |
| 6 生长抑素基因疫苗免疫的可行性和应用前景 |
| 6.1 生长抑素基因疫苗免疫的可行性 |
| 6.2 生长抑素基因疫苗在生产使用上的优势 |
| 6.2.1 基因免疫的优越性 |
| 6.2.2 湖羊生产面临的问题 |
| 7 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第三章 生长抑素DNA疫苗质粒和基因佐剂质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、细菌和细胞 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂与工具酶 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 质粒小量培养与抽提纯化 |
| 1.2.2 质粒浓缩 |
| 1.2.3 胶回收DNA |
| 1.2.4 融合基因表达产物的结构与理化特性预测 |
| 1.2.5 融合基因表达质粒的构建 |
| 1.2.6 融合基因表达质粒的酶切和测序鉴定 |
| 1.2.7 融合表达质粒PES／2SS-GMCSF在COS细胞中的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 生长抑素融合基因S／2SS和S／2SS-GMCSF表达产物的结构与理化特性 |
| 2.2 融合表达质粒pES／2SS、pEGS／2SS的鉴定 |
| 2.3 构建pES／2SS-GMCSF过程中的酶切、测序鉴定 |
| 2.4 构建pE-GMCSF过程中的酶切、测序鉴定 |
| 2.5 构建pE-CpG过程中的酶切、测序鉴定 |
| 2.6 DNA体外转染COS7细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生长抑素融合蛋白的抗原性 |
| 3.2 CpG免疫刺激序列对DNA疫苗的免疫增强作用 |
| 3.3 GM-CSF免疫佐剂克服DNA疫苗免疫原性差的作用 |
| 3.4 生长抑素基因疫苗和基因佐剂质粒的构建及表达 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 CpGDNA增强生长抑素DNA疫苗pES／2SS免疫小鼠特异性免疫应答的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 质粒及佐剂的制备 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.5 免疫应答检测 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生长抑素DNA疫苗和基因佐剂提取结果 |
| 2.2 免疫诱导的淋巴细胞增殖反应 |
| 2.3 生长抑素质粒(pES／2SS)免疫小鼠对抗体产生的影响 |
| 2.4 抗体分型检测 |
| 2.5 脾脏TH1／TH2细胞因子的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生长抑素表达质粒的免疫原性及其免疫作用机制 |
| 3.2 CpG序列增强DNA疫苗的免疫效果 |
| 3.3 CpGDNA诱导产生TH_1型免疫佐剂效应 |
| 3.3 加强免疫对免疫效果的影响 |
| 3.4 进一步提高生长抑素基因免疫反应性的途径 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 CpGDNA对生长抑素基因疫苗pES／2SS免疫小鼠生长及GH和IGF-Ⅰ的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 DNA疫苗及CpGDNA制备 |
| 1.3 动物免疫接种 |
| 1.4 血样采集及称重 |
| 1.5 激素测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各组小鼠在处理后不同时期的增重 |
| 2.2 生长抑素质粒pES／2SS免疫对GH的影响 |
| 2.3 生长抑素基因免疫对IGF-1的影响 |
| 2.4 生长与抗生长抑素抗体、GH、IGF水平相关分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生长抑素基因免疫对小鼠生长的影响 |
| 3.2 生长抑素基因免疫对GH和IGF-1的影响 |
| 4 参考文献 |
| 第六章 分子佐剂对生长抑素基因免疫湖羊羔羊的促生长作用及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 质粒的大量培养与抽提纯化 |
| 1.4 细菌DNA的提取 |
| 1.5 质粒的浓缩与稀释 |
| 1.6 实验动物与免疫、采血、称重 |
| 1.7 生长抑素抗体的检测 |
| 1.8 激素检测 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生长抑素DNA疫苗和基因佐剂的制备 |
| 2.2 生长抑素质粒免疫湖羊对抗体产生的影响 |
| 2.3 各组羔羊增重 |
| 2.4 血中GH水平 |
| 2.5 生长与抗生长抑素抗体、GH、IGF水平相关分析 |
| 3.讨论 |
| 3.1 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊免疫应答的影响 |
| 3.2 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊生长的影响 |
| 3.3 各种佐剂对生长抑素基因免疫湖羊外周血中GH和IGF-Ⅰ的影响 |
| 3.4 免疫程序的制定 |
| 4 参考文献 |
| 第七章 生长抑素DNA疫苗免疫湖羊羔羊的安全性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 DNA抽提、纯化、鉴定结果 |
| 2.2 pES／2SS和pES／2SS-GMCSF质粒(阳性对照)的PCR扩增结果 |
| 2.3 试验样品染色体基因组的PCR扩增结果 |
| 3.讨论 |
| 4 参考文献 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 创新 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
四、恶性疟原虫复合抗原DNA疫苗诱导小鼠的细胞免疫及体液免疫应答（论文参考文献）
- [1]寄生虫DNA疫苗研究进展[J]. 王宁,赵鹏鹏,张艳艳,马勋,王正荣,薄新文. 中国畜牧兽医, 2021(03)
- [2]医学原虫相关蛋白的免疫调节作用研究进展[J]. 刘冰,王奇,贺拥军,贺平. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2021(01)
- [3]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [4]巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究[D]. 刘亭岐. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]马流产沙门菌FliC和马疱疹病毒gD基因融合表达及FliC对gD质粒DNA的免疫增强效果的研究[D]. 常建新. 新疆农业大学, 2017
- [6]C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学, 2011(08)
- [7]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [8]兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究[D]. 古小彬. 四川农业大学, 2009(06)
- [9]禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪. 四川农业大学, 2009(07)
- [10]分子佐剂对生长抑素基因免疫的作用及其机制研究[D]. 薛春林. 南京农业大学, 2006(02)