一、人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化（论文文献综述）
杨阳[1]（2020）在《ESM1在三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭中的作用及机制研究》文中研究说明全世界癌症发病率和死亡率正在急速增加中,在女性中,乳腺癌是最常诊断出的癌症,是女性中与肿瘤相关死亡的主要因素。三阴性乳腺癌是指HER-2、PR和ER蛋白均为阴性的乳腺癌,占全部乳腺癌的10%-20%。三阴性乳腺癌与其他亚型乳腺癌相比具有生存率低、恶性化水平更高、易于复发、产生耐药、发生转移和发病年轻化等特点,加之TNBC缺乏在其他类型的乳腺肿瘤中表达的可靶向受体,因此治疗这种高度侵袭性乳腺癌极具有挑战性。内皮细胞特异性分子1（ESM1）是一种可在血液中自由循环的硫酸皮肤蛋白多糖。现有研究发现,ESM1在肺癌、子宫癌、肾癌、肝癌、脑胶质母细胞瘤、乳腺癌等肿瘤中明显高表达,并且已有证据表明ESM1直接参与肿瘤进展,对头颈部癌、胃癌、鼻咽癌、大肠癌和肝癌细胞的增殖和迁移有显着影响。最近研究结果显示,ESM1可作为三阴性乳腺癌预后标志物。因而探究ESM1在三阴性乳腺癌中的作用及机制具有重要意义。本研究旨在探讨ESM1在三阴性乳腺癌中增殖、迁移以及侵袭作用和其潜在的机制。我们应用人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468,构建稳定敲低的ESM1细胞系和瞬时过表达ESM1,应用transwell迁移实验和transwell小室侵袭实验、CCK8比色测定法检测、平板克隆形成实验体外检测三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,应用异种移植小鼠荷瘤实验在活体水平检测敲低ESM1对肿瘤增殖影响。我们的实验结果总结如下:1.transwell细胞迁移实验表明,与对照相比,ESM1敲低组TNBC迁移能力显着降低;ESM1过表达组TNBC细胞迁移能力显着高于对照组。2.transwell小室细胞侵袭实验表明,与对照相比,ESM1敲低组TNBC侵袭能力显着降低;ESM1过表达组TNBC细胞侵袭能力显着高于对照组。3.CCK-8实验结果显示与对照组比较,ESM1敲低组吸光值明显下降,表明增殖能力降低;与对照组相比较来说,ESM1过表达组吸光值升高且具有明显差异性,表明增值能力升高。4.平板克隆形成实验结果表明,与对照组相比,ESM1敲低组细胞克隆形成数量显着降低;ESM1过表达组与对照组相比细胞克隆形成的数量显着增高。5.小鼠荷瘤实验结果表明,与对照组相比,ESM1敲低后显着抑制肿瘤生长。综上,我们的研究表明ESM1能够促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤的生长,从而在肿瘤进展中扮演着重要的角色,但其作用机制有待进一步研究。本研究加深了对三阴性乳腺癌进展分子机理的认知,并为寻找新的预后诊断标记物和治疗新靶标提供了理论依据。
宋志鹏[2]（2020）在《GATA5基因启动子在急性心肌梗死患者中的分子遗传学研究》文中研究指明研究背景:心血管相关疾病有着极高的发病率与死亡率,急性心肌梗死（acute myocardialinfarction,AMI）属于其急危重症。GATA 结合蛋白 5（GATA binding protein 5,GATA5）是GATA家族的重要成员,通过不同通路参与高血压、房颤、先天性心脏病等心血管相关疾病的发生发展[1-4]。另外,GATA5参与调控细胞代谢[5,6]、冠状动脉发育[7-9]、血管炎症、氧化应激和内皮功能[3,10]等多个AMI相关的病理生理过程。因此,GATA5功能缺陷可增加人群的AMI易感性。研究目的:基于GATA5基因启动子在AMI患者中的遗传与功能变异信息进行分子遗传学研究,以探索GATA5基因启动子突变在AMI发生发展中的作用及其调控机制,有望为AMI的预防、诊断、治疗和发病机制研究提供新的遗传学依据。研究方法:1、遵循纳入-排除标准,共计683例参与者被纳入本次研究,其中AMI患者332例。采集所有参与者3 ml空腹外周血并从中提取基因组。2、参考NCBI中GATA5基因启动子序列设计聚合酶链式反应（PCR）引物,体外扩增目的片段后采用Sanger测序法确定变异位点。3、采用 SHEsis（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）、SPSS 等在线程序及统计学软件,分析AMI与GATA5启动子单核苷酸多态性（SNP）间的相关性。4、利用TRANSFAC在线预测软件（https://portal.genexplain.com/）预测受上诉变异位点影响的转录因子。5、采用瞬时转染的实验方法,以pGL3与pRL-TK为被转染载体,以HEK-293和H9c2为被转染细胞,用以明确GATA5启动子变异位点对其生物学活性的影响。6、凝胶迁移率变异实验（EMSA）用于检测各突变位点是否干扰某个（些）转录因子与GATA5基因启动子的结合,并应用转录因子特异性抗体确定受变异位点影响的转录因子。研究结果:1、在683例参与者GATA5基因启动子中,共发现9个变异位点。其中3个新的杂合突变（g.62476323-24GG>AA,g.62476197G>A 和 g.62476046G>A）和 3 个 SNPs[g.62476171C>T（rs1341970027）,g.62476123A>G（rs1435326263）和 g.62475977 C>G（rs1294169077）]在 5 例 AMI 患者中被发现。另外 3 个 SNPs[g.62476317G>A（rs80197101）、g.62476223C>T（rs77067995）和 g.62476271A>C（rs145936691）]在两组人群中均可被发现,值得注意的是,g.62476317G>A（rs80197101）和 g.62476223C>T（rs77067995）在 42 例 AMI 患者和 25 例对照者中被发现（X2=6.459,P=0.040;X2=6.459,P=0.040）,而 g.62476271 A>C（rs145936691）在两组中的分布相似（P>0.040）。2、Hardy-Weinberg 平衡检验显示 rs80197101 和 rs77067995 符合 Hardy-Weinberg平衡（AMI组:P=0.722,P=0.722;健康对照组:P=0.489,P=0.489）,说明我们纳入的样本具有良好的代表性,且来自于遗传平衡的群体。卡方分析显示rs80197101的“A”和rs77067995 的“T”在 AMI 组分布更高（X2=6.128,P=0.013;X2=6.128,P=0.013）;Logistic分析示,校正各混杂因素后,rs80197101“GA”和“GA+AA”依然与AMI相关（OR=2.263,95%CI:1.009～5.079,P=0.048;OR=2.297,95%CI:1.028～5.135,P=0.043）,rs77067995“CT和“CT+IT”也依然与 AMI 相关（OR=2.263,95%CI:1.009～5.079,P=0.048;OR=2.297,95%CI:1.028～5.135,P=0.043）;连锁分析示 rs80197101、rs77067995呈完美连锁不平衡（D’=1.000,r2=1.000）;单倍型分析示rs80197101、rs77067995形成的“AT”在 AMI 组的分布更高（OR=1.875,95%CI:1.132-3.106,P=0.013）。3、TRANSFAC应用程序预测受突变所干扰的某个（些）转录因子,g.62476323-24 GG>AA可能消除了 E2F相关因子和AP-2与GATA5启动子相结合的位点;g.62476197G>A可能改变了 ZFP161的结合域;g.62476046G>A可能改变了 AP-2和Kruppel-like factor 4（KLF4）的结合域;g.62476171C>T（rs1341970027）可能消除了 LRH-1 and Steroidogenic factor-1（SF-1）group 的结合域,创建了 transcription factor 7（TCF7）相关因子的结合域;g.62476123A>G（rs1435326263）新增了 BEN 的结合域;g.62475977C>G（rs1294169077）可能消除了 Nuclear receptor subfamily 1 group H member（FXR）的结合域;g.62476317G>A（rs80197101）可能消除了 Kruppel-like factor 6（KLF6）的结合域;g.62476223C>T（rs77067995）可能新增了 Small mothers against decapentaplegic（SMAD）在GATA5启动子的结合域。4、HEK-293细胞和H9c2细胞的转染数据均表明,pGL3-62475977G和pGL3-62476046A 显着降低了 GATA5 启动子活性（P<0.01）,pGL3-62476197A、pGL3-62476123G、pGL3-62476323-24AA、pGL3-g.62476171T 和pGL3-62476317A+62476223T 显着升高了 GATA5 启动子活性（P<0.05）,pGL3-62476271C并没有改变GATA5启动子活性（P>0.05）。5、EMSA 分析发现,位点 g.62476323-24GG>AA,g.62475977C>G（rs1294169077）,g.62476317G>A（rs80197101）,g.62476197G>A,g.62476223C>T（rs77067995）均显着改变了某反式作用因子与GATA5启动子的结合,但g.62476046G>A,g.62476171C>T（rs1341970027）和 g.62476123A>G（rs1435326263）并未影响其结合。研究结论:1、GATA5启动子变异可通过改变反式作用因子（如:E2F related factors、AP-2、FXR、KLF6、SMAD与ZFP161等）与GATA5启动子相应结合域的结合而影响其活性,进而通过改变GATA5表达水平,增加AMI易感性。2、Rs80197101位点的“A”和rs77067995位点的“T”为AMI的危险性等位基因,两者形成的“AT”,为AMI的危险性单倍型。
张晶晶[3]（2019）在《CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究》文中提出目的:通过体内体外实验验证CSPⅠ-plus修饰的内皮抑制素（rES-CSP）抑制肝细胞癌转移的作用,并初步探讨rES-CSP抑制肝细胞癌转移的可能机制,以期为肝细胞癌转移的治疗提供实验依据与药物开发思路。方法:1、利用大肠杆菌E.col BL21（DE3）原核表达系统表达rES-CSP重组蛋白及可溶性表达条件（诱导温度和时间）的优化。2、利用HisTrapTMHP亲和层析柱进行可溶性重组蛋白的纯化;通过RP-HPLC和BCA试剂盒检测其纯度和浓度。3、以CSPⅠ-plus和Endostar作为对照,通过CCK-8实验检测不同浓度rES-CSP的活性;细胞划痕、Transwell及黏附实验检测各组对高转移肝癌细胞HCCLM3迁移、侵袭及黏附的作用。4、慢病毒转染法将带有荧光素酶（Luc）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒转染到HCCLM3细胞株;用嘌呤霉素筛选转染后的HCCLM3细胞,并通过ATP荧光检测仪检测荧光素酶的活性,荧光显微镜观察GFP的表达情况。获得同时表达Luc和GFP的双标高转移肝癌细胞株Luc-GFP/HCCLM3。5、取对数生长期的标记Luc和GFP的HCCLM3细胞肝原位直接注射,建立裸鼠原位肝癌模型。6、实验分为①生理盐水对照组,②Endostar组,③rES-CSP组。尾静脉隔天给药,连续用药50天。每周采用动物活体成像技术实时动态观察各处理组裸鼠肝原位肿瘤生长及肝脏肿瘤转移情况。7、将成像8周后的各组裸鼠安乐死处理,病理解剖观察各处理组对裸鼠肝原位肿瘤生长及转移情况。剥离肝原位瘤块测量肿瘤体积、重量并计算抑瘤率及肺转移率。同时取裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤做组织切片。8、HE染色观察rES-CSP对肿瘤及转移灶形态学影响和裸鼠各脏器的毒副作用。9、实时荧光定量PCR法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子mRNA表达的影响。10、蛋白质免疫印迹法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。11、免疫组织化学法检测rES-CSP对肿瘤组织及转移灶血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。结果:1、获得纯度和浓度都较高的rES-CSP可溶性重组蛋白。2、体外实验表明:与空白对照组、CSPⅠ-plus和Endostar相比,rES-CSP具有抑制HCCLM3细胞增殖、迁移、侵袭及黏附的作用。3、通过鉴定显示Luc和GFP标记的高转移肝癌细胞株构建成功。4、裸鼠原位肝癌模型成功建立。利用活体成像系统连续观察原位肝癌模型组裸鼠,随着时间延长,荧光信号逐渐增强。与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组随着时间延长腹部发光减弱显着,实体观察显示rES-CSP和Endostar组的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率分别为42.4.6±5.39%和11.1 ± 1.88%。另外,HE染色表明重组蛋白能促使肿瘤坏死,抑制肿瘤血管的生成。5、组织生物发光表明与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组肝原位和肺转移灶生物发光信号明显减弱。实体观察显示对照组、Endostar组、rES-CSP组肺转移率分别为71%、50%、42.8%。另外,肺转移灶HE染色结果提示重组蛋白能抑制肿瘤细胞浸润生长。6、HE染色验证了 rES-CSP对裸鼠各重要脏器无明显毒副作用。7、与对照组相比,rES-CSP使肝癌细胞血管生成因子VEGF的蛋白表达下调,CSP I-plus的竞争抑制剂肝素钠作用后VEGF表达上调。另外,rES-CSP使肝癌细胞转移相关分子integrinβ1和MMP2的蛋白表达下调,而E-cadherin蛋白表达没有明显变化。肝素钠作用后MMP2和integrinβ1表达上调。8、与对照组相比,rES-CSP使肿瘤组织血管生成因子VEGF、转移相关分子MMP2和integrinβ1蛋白的阳性表达降低,而E-cadherin蛋白阳性表达没有明显变化。肺转移灶中各处理组转移相关分子E-cadherin、integrinβ1和MMP2蛋白表达没有显着差异。结论:1、体外实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制高转移肝癌细胞HCCLM3转移的作用;2、建立了双荧光标记的裸鼠原位肝癌模型,体内实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制肝原位肿瘤生长的作用及抑制肝脏肿瘤的肺部转移能力;3、初步确定了 rES-CSP可能是通过下调血管生成因子VEGF,转移相关分子integrinβ1和MMP2发挥抑制肿瘤生长和转移的作用,也可能通过干扰肝癌细胞表面HSPG介导的肿瘤迁移发挥抑制肝癌转移的作用。
彭婕[4]（2018）在《PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制》文中研究表明马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）属兰氏分群的C群β溶血链球菌,可引起败血症,关节炎,心内膜炎和脑膜炎。其宿主谱较广,可感染猪、马、犬、猫等多种与人类关系密切的动物。在我国,SEZ是造成猪链球菌病的重要猪源病原体,是引起猪细菌性脑膜炎的主要病原之一。同时,全球范围内已有大量人类感染SEZ引起脑膜炎的病例报道,大多数感染与密切接触患病动物或食用被污染的食物有关,严重时可导致死亡。因此,SEZ人畜共感染和致脑膜炎的特性已对人类健康构成巨大威胁。本文对PurC影响马链球菌兽疫亚种ATCC35246株致脑膜炎相关机制进行了研究。并且筛选了其他可能破坏血脑屏障的SEZ分泌蛋白。以上研究结果为进一步阐明SEZ引起脑膜炎的机制提供理论依据。1、马链球菌兽疫亚种PurC与HEK 293T细胞互作蛋白的筛选PurC（磷酰基氨基咪唑-琥珀酰基酰胺合成酶,SAICAR合成酶）为参与嘌呤生物合成途径第七步的催化酶。课题组前期对SEZ ATCC35246强毒株的全基因组进行比较基因组学分析,在其II号毒力岛中发现了 SEZ ATCC35246特有的purC基因。本研究通过 SILAC（stable isotope labeling by amino acids in cell culture）及 LC-MS/MS 筛选HEK 293T细胞中可能与PurC有相互作用的蛋白。首先通过SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6 标记的重标 HEK 293T 细胞和 Arg12C6,Lys12C6 标记的轻标 HEK 293T细胞,随后构建SEZ PurC真核表达载体purC-pAcGFP并转染重标HEK 293T细胞,同时用空载pAcGFP质粒转染轻标HEK 293T细胞,两组细胞总蛋白经1:1等量混合后,Co-IP（co-immunoprecipitation）富集结合蛋白。两次重复共检测到差异蛋白19个。经 Co-IP 及 western blot 进一步验证确定 PurC 与 Ezrin、CIP4、Elmod2 互作。2、PurC通过调节脑内皮细胞Moesin磷酸化破坏血脑屏障脑膜炎是SEZ感染的人和动物的主要症状。SEZ必须突破血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）并且逃避宿主免疫防御感染脑组织引起脑膜炎。本研究证明PurC为一种SEZ分泌的毒力因子,它可以进入人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,hBMEC）,并影响细胞骨架。前期筛选结果表明,Ezrin可能与PurC存在互作。Ezrin属于ERM蛋白家族,该家族蛋白具有组织表达差异性,在内皮细胞中主要表达形式为Moesin,因此我们通过Co-IP及SPR（surface plasmon resonance）证明Moesin与PurC互作。并进一步确认PurC的Ficdomain与Moesin的C-ERMAD结合。Moesin在非活化状态下,C-ERMAD结构域与N-端FERM结构域紧密结合。当C-ERMAD的Thr558被磷酸化时,FERM从C-ERMAD解离,使Moesin转变为活化态的p-Moesin。结果表明,PurC与活化态Moesin具有更高的结合能力,并且可以维持细胞中Moesin的磷酸化水平。p-Moesin通过N-末端结构域（FERM）与跨膜蛋白结合,C-末端结构域（C-ERMAD）与肌动蛋白（F-actin）骨架结合来调节细胞骨架结构。除了作为与细胞粘附分子相互作用的膜-细胞骨架连接分子之外,Moesin还调节鸟苷三磷酸酶（Rho GTPase）家族活性,如RhoA。Dbl为直接负责RhoA激活的GEF因子。PurC处理后,细胞中Moesin磷酸化结合RhoEGF-Dbl导致RhoA活化。随后细胞内产生大量应力纤维,细胞骨架紊乱,最终破坏血脑屏障完整性。3、PurC影响中性粒细胞跨血脑屏障迁移的机制炎症是机体面对病原菌侵袭的一种防御性反应,但是过度的免疫反应可造成严重的炎性损伤。细菌性脑膜炎是中枢神经系统常见的感染。血液中细菌须穿透主要由脑微血管内皮细胞（BMECs）组成的血脑屏障（BBB）而进入中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）,细菌产生的毒素和机体免疫应答产生的炎症也会引起组织损伤,特别是中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophil,PMNs）的过度炎症反应与CNS损伤密切相关。已知ERM蛋白在中性粒细胞迁移过程中扮演重要角色。本研究证明PurC能够与中性粒细胞Ezrin互作,并且使细胞中Ezrin Thr567磷酸化水平显着升高。磷酸化的Ezrin能够结合Dbl活化Rac1,引起细胞内F-actin聚集,使细胞产生尾足。同时,磷酸化的Ezrin能够将选择蛋白受体CD44和PSGL-1募集在细胞尾足部位,以促进其与内皮细胞表面选择蛋白结合,进而引起大量的中性粒细胞穿透血脑屏障。4、SEZ与mBMEC互作分泌蛋白的筛选SEZ会引起人和动物的脑膜炎。本研究发现SEZ的分泌蛋白对小鼠脑微血管内皮细胞（mBMEC）具有细胞毒性,并可能促进SEZ穿过血脑屏障（BBB）。运用SILAC标记获得Arg13C6,Lys13C6标记的重标SEZ和Arg12C6,Lys12C6标记的轻标SEZ。通过LC-MS/MS检测,筛选到与小鼠脑微血管内皮细胞（mBMECs）相互作用的SEZ分泌蛋白。质谱结果共鉴定出49种有效的肽,与可以匹配25种SEZ蛋白。生物信息学结果表明,大多数是细胞质蛋白,这些蛋白可能具有破坏宿主血脑屏障的潜在功能。其中一些蛋白在其他细菌中为已知的毒力因子,包括烯醇化酶。进一步试验证明,烯醇化酶为SEZ分泌蛋白,并且可以粘附于mBMEC。烯醇化酶可作为保护性抗原有效保护小鼠免于感染SEZ,并且其抗体显着降低了 SEZ培养上清对mBMECs的细胞毒性。
曹冲[5]（2017）在《牙龈素对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞的作用及增殖调控研究》文中认为目的:通过研究牙龈卟啉单胞菌提取的牙龈素对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖凋亡及炎症因子表达的影响,探讨牙龈素在大鼠主动脉平滑肌细胞增殖中的作用及其机制,为慢性牙周炎与动脉粥样硬化的相关性研究提供理论依据。方法:第一部分:运用丙酮有机沉淀、透析及差速离心法自牙龈卟啉单胞菌W83菌株中分离提取牙龈素混合物,检测其酶活性,测定蛋白浓度;原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞,分别以100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml,12μg/ml,6μg/ml,3μg/ml,1μg/ml,0μg/ml激活牙龈素干预48小时,CCK-8法检测细胞增殖。确定最佳牙龈素作用浓度后,以5μM、10μM、20μM、40μM精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Rgp）抑制剂（KYT-1）,赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Kgp）抑制剂（KYT-36）抑制牙龈素酶活后干预大鼠主动脉平滑肌细胞,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;免疫组化检测平滑肌细胞收缩型标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白及合成型标志蛋白骨桥蛋白;凋亡试剂盒检测大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡情况;ELISA检测大鼠主动脉平滑肌细胞IL-8及TNF-α表达水平,并比较Rgp与Kgp作用差异。第二部分:设计骨桥蛋白siRNA序列,构建骨桥蛋白过表达质粒,转染至大鼠主动脉平滑肌细胞,确定转染效率。流式细胞仪检测细胞周期,realtime PCR检测增殖核抗原mRNA水平、α-平滑肌肌动蛋白及调宁蛋白mRNA水平,Westernblot检测α-平滑肌肌动蛋白及调宁蛋白蛋白水平。第三部分:表达谱基因芯片初筛牙龈素干预大鼠主动脉平滑肌细胞差异表达基因,realtime PCR验证。结果:第一部分:1)成功自牙龈卟啉单胞菌W83菌株中提取分离牙龈素,其Rgp酶活性为280U/L,Kgp酶活性为84U/L;2)牙龈素干预后,大鼠主动脉平滑肌细胞发生增殖,以牙龈素浓度为12μg/ml时增殖最显着（F=42.048,P<0.001）,10μM KYT1、KYT36及KYT1+KYT36抑制牙龈素酶活后,大鼠主动脉平滑肌细胞增殖明显降低,抑制其促增殖作用（F=12.109,P<0.001）,但各抑制剂之间差异无统计学意义（P>0.05）;3)牙龈素影响大鼠主动脉平滑肌细胞细胞周期,G0/G1期细胞数明显减少（25.87±4.58）,S期细胞数明显增加（49.90±3.63）,促进其由G0/G1期进入S期（P<0.001）;4)牙龈素干预后,大鼠主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达明显增加,发生了表型转化;5)牙龈素干预后,大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡率未显着增加,差异无统计学意义（P>0.05）;6)牙龈素干预48h后,炎症因子IL-8、TNF-α表达显着增加（IL-8:F=8.241,P=0.0014;TNF-α:F=44.14,P<0.001）。第二部分:1)成功构建骨桥蛋白-siRNA,50μM骨桥蛋白-siRNA F02 24h转染效率最高,转染后骨桥蛋白mRNA水平降低;2)成功构建骨桥蛋白过表达质粒,转染效率为60%,转染后骨桥蛋白mRNA水平显着增加;3)骨桥蛋白-siRNA转染后,大鼠主动脉平滑肌细胞细胞周期阻滞于G0/G1期,G0/G1期细胞数显着增加（55.43±1.50）,S期细胞数显着减少（26.87±3.52）,增殖核抗原mRNA表达显着降低（P<0.001）;骨桥蛋白过表达质粒转染后,大鼠主动脉平滑肌细胞细胞周期由G0/G1期进入S期,G0/G1期细胞数显着减少（38.90±2.67）,增殖核抗原mRNA表达显着增加（P<0.001）;4)骨桥蛋白-siRNA转染后,α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白mRNA水平显着增加（P<0.001）;骨桥蛋白过表达质粒转染后,α-平滑肌肌动蛋白、调宁蛋白mRNA水平显着减少（P<0.001）。第三部分:表达谱芯片筛选出128个上调基因,42个下调基因;realtime PCR结果显示骨桥蛋白、αvβ3 mRNA水平显着增加。结论:1)牙龈素促进大鼠主动脉平滑肌细胞增殖,影响大鼠主动脉平滑肌细胞细胞周期,促使其由G0/G1期进入S期,Rgp与Kgp之间促增殖作用无明显差异;2)牙龈素促进大鼠主动脉平滑肌细胞发生细胞表型转变由收缩型转变为合成型,标志蛋白骨桥蛋白表达增加;2)牙龈素对大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的作用不明显;3)牙龈素促进大鼠主动脉平滑肌细胞表达IL-8与TNF-α,Rgp与Kgp之间作用无明显差异;4)骨桥蛋白通过调节α-平滑肌肌动蛋白及调宁蛋白影响大鼠主动脉平滑肌细胞细胞增殖;5)牙龈素通过骨桥蛋白-整合素-黏着斑激酶-细胞骨架蛋白途径调节大鼠主动脉平滑肌细胞的增殖。
龚薇[6]（2009）在《HMGB1酸性尾端抗菌相关功能位点解析及以该分子为靶点的抗炎措施研究》文中研究说明第一部分HMGB1酸性尾端抗菌相关功能位点解析研究目的:高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box-1,HMGB1）属高迁移率族蛋白超家族成员,由A box、B box及酸性尾端三个结构域组成,其广泛存在于真核细胞核内,也可存在于胞浆及细胞外等多个部位,在机体正常生理活动维持和某些疾病状态下发挥多种重要功能。相对于其他功能而言,抗菌活性是HMGB1的一项新功能。我们前期在对HMGB1功能机制进行研究时发现:重组人HMGB1具有抗菌活性,然而缺失由30个氨基酸残基组成的酸性尾端的突变体蛋白则丧失抗菌能力;另外,我们还证实了单独的A box和B box不具有抗菌活性。因此,HMGB1酸性尾端对其抗菌活性的发挥至关重要。但是,针对我们获得的这一新发现,至少还有两个问题需进一步探讨:酸性尾端区域中参与抗菌作用的详细功能位点尚待解析;单独的酸性尾端是否即有抗菌能力还有待鉴定。本部分实验旨在寻找HMGB1酸性尾端中抗菌相关功能位点,并观察单独酸性尾端的抗菌活性。方法及结果:1.人HMGB1酸性尾端不同位点缺失突变体的制备（1）用已克隆于pUC19载体中测序正确的、编码人HMGB1的cDNA为模板,经常规PCR或一步反向PCR致突变策略分别扩增得到11种人HMGB1酸性尾端不同位点缺失突变体蛋白的编码序列,并成功的构建了重组质粒:pUC19/mHMGB1 -211-215、pUC19/mHMGB1 -206-215、pUC19/mHMGB1 -201-215、pUC19/mHMGB1 -196-215、pUC19/mHMGB1 -191-215、pUC19/mHMGB1 -186-200、pUC19/mHMGB1 -196-210、pUC19/mHMGB1 -196-205、pUC19/mHMGB1 -198-207、pUC19/mHMGB1 -201-210、pUC19/mHMGB1 -201-205。（2）将上述测序正确的各突变体编码序列分别亚克隆到适于表达毒性蛋白的原核表达载体pQE-80L中,成功地构建了重组原核表达质粒pQE-80L/mHMGB1 -211-215、pQE-80L/mHMGB1 -206-215、pQE-80L/mHMGB1 -201-215、pQE-80L/mHMGB1 -196-215、pQE-80L/mHMGB1 -191-215、pQE-80L/mHMGB1 -186-200、pQE-80L/mHMGB1-196-210、pQE-80L/mHMGB1 -196-205、pQE-80L/mHMGB1 -198-207、pQE-80L/mHMGB1 -201-210、pQE-80L/mHMGB1 -201-205。（3）将上述重组原核表达质粒分别转化于大肠杆菌DH5α,在终浓度0.5mmol/L的IPTG、37℃诱导表达3h。SDS-PAGE分析可见,目的蛋白相对分子质量均在30kDa- 25kDa之间,均主要以分泌形式表达。经Ni2+-NTA系统有效纯化后,我们成功的制备了11种人HMGB1酸性尾端不同位点缺失的突变体蛋白:mHMGB1 -211-215、mHMGB1 -206-215、mHMGB1 -201-215、mHMGB1 -196-215、mHMGB1 -191-215、mHMGB1 -186-200、mHMGB1 -196-210、mHMGB1 -196-205、mHMGB1 -198-207、mHMGB1 -201-210、mHMGB1 -201-205。2.人HMGB1酸性尾端不同位点缺失突变体抗菌功能的检测与比较体外抗菌实验（试管稀释法、琼脂扩散法）结果证实:11种人HMGB1酸性尾端不同位点缺失突变体中mHMGB1 -211-215、mHMGB1 -206-215、mHMGB1 -186-200对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109、ATCC25922、DH5α具有不同程度的抗菌活性,其中对DH5α抗菌活性最弱;而对绿脓杆菌则无此抗菌活性。其余突变体抗菌活性均消失。上述实验结果表明:人HMGB1酸性尾端中201-205氨基酸残基对其抗菌功能的发挥至关重要。3.人工合成的人HMGB1酸性尾端抗菌活性研究（1）人工合成30个氨基酸残基组成的人HMGB1酸性尾端肽段。（2）体外抗菌实验（试管稀释法、琼脂扩散法）结果显示:该肽段对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌JM109、ATCC25922、DH5α具有不同程度的抗菌活性,其中对DH5α抗菌活性最弱;而对绿脓杆菌则无此抗菌活性。因此,单独的人HMGB1酸性尾端肽段即具有抗菌活性。结论:1.人HMGB1酸性尾端中201-205氨基酸残基在抗菌活性的发挥中起至关重要的作用。2.人工合成30个氨基酸残基组成的人HMGB1酸性尾端肽段对部分细菌具有明确的抗菌活性,从另一侧面证实HMGB1的酸性尾端对其抗菌功能的发挥至关重要。第二部分HMGB1为靶点的抗炎措施研究研究目的:HMGB1是一种具有宽治疗窗口期的关键炎症因子,在多种急、慢性炎症疾病的发生和发展过程中起着极为重要的作用,目前以该分子为靶标的抗炎措施越来越受到人们的关注。现有研究证实,其发挥致炎作用的主要功能域为B box。然而,体外表达的单独A box能抑制HMGB1致炎活性,有明确的抗炎功能。同时,酸性尾端具有调节A box、B box结构和功能的作用。如果能将HMGB1具有抗炎功能的A box与具有抗菌功能的酸性尾端融合就有可能得到兼具抗炎、抗菌双功能的衍生分子。又有研究显示,被分泌至细胞外的HMGB1除是一种重要的炎症细胞因子外,还参与激活机体自身免疫系统,与多种自身免疫性疾病密切相关。中药提纯单体青藤碱（sinomenine,SIN）具有抗炎、免疫抑制等药理作用,广泛应用于临床治疗类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）等慢性炎性自身免疫性疾病,并取得较好疗效。然而,SIN是否可影响HMGB1表达目前尚未见报道。本部分实验以HMGB1为靶点,制备由HMGB1 A box及酸性尾端组成的兼具抗炎、抗菌双功能的衍生分子;同时研究SIN对HMGB1表达的影响,并初步探讨其可能机制。方法及结果:1.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子的制备（1）以克隆于pUC19载体中测序正确的、编码人HMGB1的cDNA为模板,经一步反向PCR,在缺失B box编码序列的同时,将A box与酸性尾端的编码序列直接相连（此连接为刚性连接）,命名为pUC19/rHMGB1 A+T。（2）再用上述克隆于pUC19载体上测序正确的、处于刚性连接的A box与酸性尾端编码序列为模板,经多次一步反向PCR在A box与酸性尾端编码序列之间引入一个柔性连接子（Gly4Ser）3的编码序列（此连接为柔性连接）,命名为pUC19/rHMGB1 A+Linker+T。（3）将测序正确的A box与酸性尾端刚性、柔性连接融合分子编码序列分别亚克隆于原核表达载体pQE-80L,分别命名为pQE-80L/rHMGB1 A+T、pQE-80L/rHMGB1 A+Linker+T,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达上述融合蛋白。SDS-PAGE分析可见,两融合蛋白的相对分子质量分别约为16kDa和18kDa。经Ni2+-NTA纯化系统,两融合蛋白得到有效纯化,纯化后的目的蛋白在SDS-PAGE上均呈现单一条带。2.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗炎功能的鉴定与比较（1）体外抗炎实验证实,两融合蛋白与单独A box类似均能抑制重组HMGB1诱导的人单核细胞THP-1分泌炎症因子肿瘤坏死因子a（TNF-a）和白细胞介素6（IL-6）,两融合蛋白抑制炎症因子作用均比单独的A box强,且柔性连接的融合蛋白抗炎能力是三者中最强的。（2）在LPS诱导的小鼠内毒素血症模型（模拟内毒素引起的系统性炎症）中两融合蛋白均能降低血清炎症因子TNF-a、IL-6的浓度并能提高小鼠的存活率;同体外实验结果类似柔性连接的融合蛋白降低血清中炎症因子浓度及提高小鼠存活率作用更强。3.HMGB1 A box和酸性尾端融合分子抗菌功能的检测与比较体外抗菌实验（试管稀释法、琼脂扩散法）结果显示,A box与酸性尾端刚性连接和柔性连接两融合蛋白均能不同程度抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（JM109、ATCC25922、DH5α）生长,但二者的抑制细菌生长能力并无统计学差异;均对绿脓杆菌无抗菌活性。4.盐酸青藤碱抑制基础水平和LPS诱导的HMGB1表达（1）在人内皮细胞EA.hy926中盐酸青藤碱可抑制基础水平的HMGB1 mRNA和蛋白质表达,且呈剂量依赖性。（2）在人内皮细胞EA.hy926中盐酸青藤碱可抑制LPS诱导水平的HMGB1 mRNA和蛋白质表达,且呈剂量依赖性。5.盐酸青藤碱抑制HMGB1基因启动子活性（1）成功克隆到具有活性的HMGB1基因5’上游启动子区域（-2484+200）,并构建长度不同的HMGB1基因启动子区域截短突变体（-1998+200、-1598+200、-1198+200、-798+200、-397+200）报告基因检测质粒。（2）荧光素酶（Luc）报告基因检测实验结果知,盐酸青藤碱可抑制-2484+200、-1998+200、-1598+200、-1198+200报告基因质粒启动子活性,但对-798+200、-397+200报告基因质粒启动子活性无影响,此结果表明HMGB1基因5’上游启动子区域-1198-798序列在青藤碱抑制HMGB1转录中起至关重要的作用。结论:1.人HMGB1 A box与酸性尾端刚性连接和柔性连接两种衍生分子均是兼具抗炎、抗菌的双功能分子;酸性尾端可增强A box的抗炎活性,且柔性连接的融合分子抗炎活性强于刚性连接的融合分子,但其二者在抗菌活性方面无差异;2.青藤碱可抑制基础水平及LPS诱导的HMGB1表达,且HMGB1基因5’上游启动子区域-1198-798序列与青藤碱抑制HMGB1转录密切相关。
陈孝宇[7]（2009）在《Endocan可溶性表达和纯化及其转染MDCK细胞对OPN表达的影响》文中进行了进一步梳理目的人内皮细胞特异性分子-1（Human endothelia-specific molecule-1, ESM-1）又被称为Enodcan,构建其原核和真核表达载体。原核质粒转化进入大肠杆菌进行原核表达以及产物的初步纯化。含重组Endocan基因的真核质粒转染犬肾小管上皮MDCK细胞,观察Endocan的表达以及对骨桥蛋白OPN表达的影响。方法用PCR方法扩增Endocan的cDNA,扩增产物与pET32a连接后,转化入克隆菌株DH5α中,经抗生素筛选挑取阳性克隆,阳性克隆直接测序鉴定。在克隆菌株中扩增重组质粒,提取质粒转化表达菌株Rosetta-gamiTM（DE3）中,由抗生素筛选挑取阳性克隆,并由菌液PCR进行鉴定。用IPTG诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE鉴定后,上清过镍柱纯化。应用PCR扩增出Endocan cDNA全长序列,酶切后导入pcDNA3.1/myc-his A多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-Endocan,双酶切及测序鉴定;瞬时转染MDCK细胞,Western blot检测Endocan和OPN表达。结果经双酶切鉴定及测序分析证明所构建质粒为Endocan重组质粒。原核表达SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子量为40kD,表达量约占菌体总蛋白的84%。100mM咪唑洗脱下目的蛋白。真核瞬时转染后Western blot结果表明转染成功,Endocan表达量增加,且OPN随其而增加。结论成功构建了重组Enodcan原核和真核表达载体。Endocan在表达菌株中获得表达,且初步纯化,为进一步研究Endocan的功能及其临床意义奠定了良好基础。真核瞬时转染的Endocan可促进MDCK表达OPN。
栾嘉[8]（2008）在《第三军医大学学报2008年第30卷总目次》文中研究表明
孙红[9]（2008）在《抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究》文中认为炎症是机体的一种重要的基本病理过程。各种炎症虽然有其特殊性,但从局部的病理变化看来,它们有着不少共同点,即都是机体对致炎因子的损伤作用所产生的一种反应,最新的医学研究发现,当炎症的程度严重或发展成慢性炎症时,它可能导致肿瘤、心血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的疾病（如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松症等）的发生。细胞间粘附分子-1（ICAM-1）作为重要的致炎因子,在炎症反应、免疫监督等过程中起着重要的作用。以上许多疾病过程中可见ICAM-1的异常表达,因此阻遏ICAM-1的表达为以上疾病的诊断和治疗提供了新的策略。本研究在已制备的抗ICAM-1单克隆抗体的基础上,从分泌该单抗的杂交瘤细胞株中克隆出VH和VL基因,组装成ScFv基因,将ScFv基因插入原核表达载体pET-22b（+）中,转化宿主菌中进行表达,之后对表达的包涵体进行了复性和纯化。最后通过体外细胞实验和体内动物实验检测ScFv抗体的生物学活性。细胞实验表明,制备的ScFv能有效地抑制内皮细胞与单核细胞之间的粘附;动物实验证明此ScFv对小鼠无菌性炎症有明显的抑制作用。本课题为进一步治疗炎症性疾病奠定了基础。
张岩平[10]（2008）在《小鼠血吸虫病肝组织中内皮细胞特异性分子-1的表达及黄芪总苷对其影响》文中研究说明目的:研究内皮细胞特异性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）在小鼠正常肝组织及血吸虫病肝组织中不同时期的表达、分布及其作用,并且观察黄芪总苷（astrogalosides,AST）对血吸虫病肝组织中病理形态学变化及ESM-1表达的影响。方法:将钉螺孵育后逸出的中国大陆株日本血吸虫尾蚴,以盖玻片法经小鼠腹部皮肤攻击感染,总计感染120只ICR小鼠,每只小鼠感染30±1条日本血吸虫尾蚴。实验小鼠造模35d后随机分为AST高剂量（20mg/kg·d）组、AST低剂量（10mg/kg·d）组、阳性药（护肝片,540mg/kg·d）组、模型组,每组30只,灌胃给药1次/d。实验小鼠均于感染血吸虫尾蚴40d后以吡喹酮（500mg/kg·d）治疗2 d,药物均以5 g/L羧甲基纤维素钠为溶媒,10 ml/kg·d灌胃。正常对照组为30只健康鼠。模型组和正常组均以等量5 g/L羧甲基纤维素钠灌胃。分别于感染后第6、10、14wk末每组随机处死10只小鼠,取肝脏组织作常规病理学检查,并制作组织芯片;应用HE和天狼猩红染色法观察小鼠虫卵结节大小及纤维化程度;采用免疫组织化学和原位分子杂交技术检测ESM-1 mRNA及蛋白,免疫组织化学染色结果以细胞质中出现明显黄色或黄褐色颗粒为阳性,采用图像分析技术进行相对定量分析,以平均光密度（mean optical density,MOD）值表示免疫染色结果。原位分子杂交结果以细胞质和/或细胞核出现明显黄色或黄褐色颗粒为阳性染色,计数每高倍视野肝间质内阳性细胞数。结果:（1）感染后6wk,汇管区可见大量嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润,亦可见一定数量的单核细胞浸润。肝内病变主要是散在分布于汇管区的急性虫卵结节,部分汇管区见虫卵聚集成簇,虫卵结节周围可见少量胶原纤维。AST两个剂量组病理形态学改变与模型组差异无显着性（P＞0.05）;10wk和14wk末,血吸虫肝病的主要表现为慢性虫卵结节和纤维化结节,虫卵周围主要为梭形的成纤维细胞和胶原纤维包绕,可见胶原纤维沿汇管区延伸并相互连接,部分肝细胞间亦可见少量胶原纤维。AST两个剂量组虫卵结节面积及纤维化程度较模型组明显降低（P＜0.01,P＜0.05）。（2）ESM-1 mRNA及蛋白在正常小鼠肝组织中仅血管内皮细胞和部分肝细胞有较弱阳性反应,主要定位于细胞质。（3）血吸虫肝病组织中,ESM-1蛋白免疫染色定位于细胞质,主要分布在虫卵结节和肝间质的各种炎细胞（单核细胞、粒细胞及淋巴细胞）、成纤维细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肝细胞。（4）血吸虫肝病组织中,ESM-1 mRNA在细胞中定位于细胞质和/或细胞核,在组织中主要分布在虫卵结节和肝间质,在炎细胞（单核细胞、粒细胞及淋巴细胞）、胆管上皮细胞、血管内皮细胞和肝细胞表达,成纤维细胞未检测出ESM-1 mRNA。（5）血吸虫肝病组织中（模型组）,ESM-1蛋白的MOD值均高于相应的正常对照组,10wk及14wk时较6wk时显着增高（P＜0.01）,但10wk和14wk间比较差异无显着性（P＞0.05）;6wk时AST高、低剂量组和模型组之间ESM-1蛋白水平差异无显着性（P＞0.05）,10wk和14wk时AST两个剂量组ESM-1的蛋白水平低于模型组（P＜0.01）;10wk时AST高、低剂量组ESM-1 mRNA阳性细胞计数低于模型组（P＜0.01）。结论:小鼠血吸虫病肝组织中,炎细胞可能是产生ESM-1的主要细胞之一,成纤维细胞可能存在ESM-1受体。推测ESM-1可能通过旁分泌作用参与血吸虫病肝纤维化过程,AST可能抑制ESM-1蛋白翻译,或抑制成纤维细胞中ESM-1受体的表达,或抑制ESM-1与受体的结合,并可能通过这一途径抑制血吸虫病肝纤维化过程。
二、人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化（论文提纲范文）
（1）ESM1在三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 内皮细胞特异性分子-1的分子结构 |
| 1.2.2 内皮细胞特异性分子-1在癌症中表达 |
| 1.2.3 内皮细胞特异性分子1作为癌症血管生成的生物标志物 |
| 1.2.4 内皮细胞特异性分子1作为癌症的预后标志物 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 培养基及主要溶液的配制 |
| 2.1.4 主要实验器材 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.2.3 细胞RNA和浓度测定 |
| 2.2.4 cDNA模版制备 |
| 2.2.5 SYBR Green法荧光定量PCR |
| 2.2.6 质粒提取 |
| 2.2.7 迁移实验 |
| 2.2.8 侵袭实验 |
| 2.2.9 克隆形成实验 |
| 2.2.10 cck-8法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 裸鼠脂肪垫成瘤 |
| 2.2.12 细胞转染 |
| 2.3 生信分析 |
| 2.3.1 IPA工具简介 |
| 2.3.2 ESM1在乳腺癌中的表达及药物筛选 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ESM1在乳腺癌中的表达上调并与三阴性乳腺癌进展相关 |
| 3.2 ESM1敲低和过表达载体效率检测 |
| 3.3 sh ESM1 抑制MDA-MB-231 细胞增殖、迁移及侵袭 |
| 3.4 sh ESM1 抑制MDA-MB-468 细胞增殖、迁移和侵袭 |
| 3.5 ESM1 过表达促进三阴性乳腺癌MDA-MB-468和MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭 |
| 3.6 敲低ESM1在体内抑制三阴性乳腺癌肿瘤发展 |
| 3.7 通过生物信息学分析探索与ESM1相关的调控网络和靶向药物 |
| 4.讨论 |
| 5.总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 :ESM1及其上下游分子靶向药物列表 |
| 致谢 |
（2）GATA5基因启动子在急性心肌梗死患者中的分子遗传学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 GATA结合蛋白5与急性心肌梗死相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录、附图表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评审及答辩情况表 |
（3）CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 原发性肝细胞癌的研究进展 |
| 1.1.2 重组人内皮抑制素 |
| 1.1.3 肝癌的分子靶向治疗研究 |
| 1.1.4 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 |
| 1.1.5 疟原虫环子孢子蛋白 |
| 1.1.6 前期研究结果及本课题研究思路 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究思路 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 rES-CSP可溶性重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 2.2.2 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.3 rES-CSP可溶性重组蛋白纯度及浓度测定 |
| 2.2.4 CCK-8 检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 划痕和Transwell检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞迁移的影响 |
| 2.2.6 Transwell检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞侵袭的影响 |
| 2.2.7 MTT法检测rES-CSP对 HCCLM3 细胞黏附的影响 |
| 2.2.8 慢病毒转染法构建Luc-GFP标记的人肝癌细胞株 |
| 2.2.9 细胞悬液肝原位直接注射法构建裸鼠原位肝癌模型 |
| 2.2.10 实验动物分组及给药 |
| 2.2.11 小动物活体成像系统观察裸鼠肝原位肿瘤生长情况 |
| 2.2.12 病理解剖观察裸鼠肝原位肿瘤生长及肺转移情况 |
| 2.2.13 苏木精-依红染色法 |
| 2.2.14 免疫组织化学法 |
| 2.2.15 实时荧光定量PCR法 |
| 2.2.16 蛋白免疫印迹法 |
| 2.2.17 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达和制备 |
| 3.1.1 rES-CSP可溶性重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.1.2 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达纯化及鉴定 |
| 3.2 体外实验检测rES-CSP对肝癌细胞HCCLM3 转移的影响 |
| 3.2.1 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞增殖的影响 |
| 3.2.2 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞迁移的影响 |
| 3.2.3 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞侵袭的影响 |
| 3.2.4 rES-CSP重组蛋白对HCCLM3 细胞黏附的影响 |
| 3.3 裸鼠原位肝癌模型的构建 |
| 3.3.1 扩增luciferase(Luc)基因 |
| 3.3.2 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.3 肝癌细胞转染后的GFP荧光鉴定 |
| 3.3.4 阳性克隆细胞株荧光素酶活性分析 |
| 3.3.5 HCCLM3-Luc-GFP细胞株接种至肝原位 |
| 3.4 rES-CSP抑制裸鼠肝原位肿瘤生长的作用 |
| 3.4.1 裸鼠肝原位肿瘤Luc发光情况观察 |
| 3.4.2 解剖观察 |
| 3.4.3 肿瘤组织HE染色观察 |
| 3.5 rES-CSP抑制裸鼠肝原位肿瘤转移的作用 |
| 3.5.1 裸鼠主要脏器生物发光观察 |
| 3.5.2 解剖观察 |
| 3.5.3 转移灶HE染色观察 |
| 3.6 rES-CSP对裸鼠体重和主要脏器的影响 |
| 3.6.1 裸鼠的体重变化 |
| 3.6.2 裸鼠主要脏器的病理变化 |
| 3.7 初步研究rES-CSP抑制肝细胞癌生长及转移的可能机制 |
| 3.7.1 rES-CSP对 HCCLM3 细胞血管生成相关因子基因及蛋白表达的影响 |
| 3.7.2 rES-CSP对 HCCLM3 细胞转移相关分子基因及蛋白表达的影响 |
| 3.7.3 rES-CSP对肝原位肿瘤血管生成因子及转移相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.7.4 rES-CSP对肺转移灶中转移相关分子蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 rES-CSP可溶性重组蛋白的表达 |
| 4.2 rES-CSP体外抑制肝癌细胞转移的作用 |
| 4.3 rES-CSP体内抑制裸鼠肝原位肿瘤转移的作用 |
| 4.4 rES-CSP抑制肝细胞癌转移的可能机制 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（4）PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 细菌性脑膜炎发病机制的研究进展 |
| 1 中枢神经系统屏障的结构与功能 |
| 1.1 血-脑屏障 |
| 1.2 血-脑脊液屏障 |
| 2 细菌性脑膜炎发病机制的一般特性 |
| 2.1 细菌突破宿主先天免疫引起败血症 |
| 2.2 细菌与中枢神经系统屏障相互作用 |
| 3 常见细菌性脑膜炎发病机制的研究进展 |
| 3.1 肺炎链球菌脑膜炎 |
| 3.2 脑膜炎球菌脑膜炎 |
| 3.3 单增李斯特菌脑膜炎 |
| 3.4 猪链球菌脑膜炎 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二章 马链球菌兽疫亚种PurC与HEK 293T细胞互作蛋白的筛选 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂及材料 |
| 1.3 载体构建 |
| 1.4 质粒转染 |
| 1.5 间接免疫荧光 |
| 1.6 细胞氨基酸的稳定同位素标记 |
| 1.7 筛选互作蛋白样品制备 |
| 1.8 还原烷基化蛋白质消化 |
| 1.9 质谱检测 |
| 1.10 数据分析 |
| 1.11 免疫共沉淀 |
| 1.12 Western blot |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC-pAcGFP真核表达载体构建 |
| 2.2 PurC的细胞内表达及鉴定 |
| 2.3 SILAC方法筛选HEK 239T细胞中与PurC互作的蛋白 |
| 2.4 质谱检测结果 |
| 2.5 互作蛋白的真核表达载体构建 |
| 2.6 PurC与筛选蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 PurC通过调节脑内皮细胞Moesin磷酸化破坏血脑屏障 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 载体构建 |
| 1.4 细菌生长曲线测定 |
| 1.5 动物试验 |
| 1.6 蛋白表达及纯化 |
| 1.7 PurC兔多克隆抗体制备 |
| 1.8 细菌分泌蛋白提取 |
| 1.9 SEZ穿透体外BBB模型试验 |
| 1.10 活细胞成像 |
| 1.11 检测PurC对体外BBB模型完整性的影响 |
| 1.12 Latex beads包被 |
| 1.13 Dot blot |
| 1.14 电镜样品处理 |
| 1.15 细胞骨架染色 |
| 1.16 免疫共沉淀 |
| 1.17 SPR |
| 1.18 Western blot |
| 1.19 hBMEC Moesin基因沉默细胞的构建 |
| 1.20 细胞内Moesin磷酸化水平检测 |
| 1.21 RhoA活化水平检测 |
| 1.22 RhoGTP/GDP交换试验 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC基因缺失株及互补株构建结果 |
| 2.2 载体构建结果 |
| 2.3 细菌生长曲线 |
| 2.4 动物试验 |
| 2.5 细菌侵袭hBMEC试验结果 |
| 2.6 细菌穿透BBB模型试验结果 |
| 2.7 蛋白表达及纯化 |
| 2.8 PurC为SEZ分泌蛋白的鉴定 |
| 2.9 PurC处理后在细胞中的分布情况 |
| 2.10 PurC对BBB模型的影响 |
| 2.11 PurC与Moesin之间的互作关系 |
| 2.12 PurC对Moesin磷酸化的影响 |
| 2.13 PurC与细胞内Moesin磷酸化之间的关系 |
| 2.14 PurC对细胞内RhoA活化水平的影响 |
| 2.15 PurC活化RhoA的机制 |
| 2.16 Moesin基因沉默细胞的构建 |
| 2.17 PurC对Moesin基因沉默细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 PurC影响中性粒细胞跨血脑屏障迁移的机制 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 动物试验 |
| 1.4 荧光定量PCR检测 |
| 1.5 中性粒细胞穿透试验 |
| 1.6 细胞染色及显微镜观察 |
| 1.7 免疫共沉淀及western blot |
| 1.8 SPR |
| 1.9 Rac1活化及检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 purC基因对SEZ感染引起的脑组织炎症损伤程度的影响 |
| 2.2 PurC对dHL60细胞形态的影响 |
| 2.3 PurC对dHL60细胞穿透BBB速率的影响 |
| 2.4 PurC对细胞内Ezrin磷酸化水平的影响 |
| 2.5 PurC刺激细胞形成尾足的机制 |
| 2.6 p-Ezrin与细胞PSGL-1及CD44之间的互作关系 |
| 2.7 封闭选择蛋白或其受体对中性粒细胞迁移的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SEZ与mBMEC互作分泌蛋白的筛选 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 细胞和菌株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 体外血脑屏障模型构建 |
| 1.4 SEZ穿透血脑屏障模型试验 |
| 1.5 SILAC标记SEZ及培养上清蛋白提取 |
| 1.6 培养上清蛋白处理bEnd3细胞 |
| 1.7 全蛋白溶液蛋白酶解消化 |
| 1.8 质谱检测 |
| 1.9 质谱数据分析 |
| 1.10 烯醇化酶的原核表达及纯化 |
| 1.11 Eno兔多克隆抗体的制备 |
| 1.12 SEZ分泌蛋白提取 |
| 1.13 细胞活性检测 |
| 1.14 Western blot |
| 1.15 间接免疫荧光 |
| 1.16 免疫保护试验 |
| 1.17 细胞被动免疫保护试验 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 血脑屏障模型构建 |
| 2.2 SEZ穿透体外血脑屏障 |
| 2.3 SEZ培养上清对细胞的毒性检测 |
| 2.4 SEZ标记效率检测 |
| 2.5 SEZ可能与bEnd3细胞结合的蛋白筛选 |
| 2.6 rEno融合蛋白的纯化结果 |
| 2.7 Eno为SEZ分泌蛋白的鉴定 |
| 2.8 Eno可对bEnd.3细胞黏附性的检测 |
| 2.9 免疫保护试验结果 |
| 2.10 细胞被动免疫保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 全文创新性 |
| 致谢 |
| 博士期间发表及待发表的论文 |
| 附录 |
（5）牙龈素对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞的作用及增殖调控研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 牙龈素对血管平滑肌细胞的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法和步骤 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 OPN在血管平滑肌细胞增殖中的作用 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法和步骤 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 牙龈素干预血管平滑肌细胞前后的差异表达分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法与步骤 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学硕士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）HMGB1酸性尾端抗菌相关功能位点解析及以该分子为靶点的抗炎措施研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 HMGB1 酸性尾端抗菌相关功能位点解析及以该分子为靶点的抗炎措施研究 |
| 第一部分 HMGB1 酸性尾端抗菌相关功能位点解析 |
| 前言 |
| 实验一 人HMGB1 酸性尾端不同位点缺失突变体的制备 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 人HMGB1 酸性尾端不同位点缺失突变体抗菌功能的检测与比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验三 人工合成的人HMGB1 酸性尾端抗菌活性研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第二部分 HMGB1 为靶点的抗炎措施研究 |
| 前言 |
| 实验一 HMGB1 A box 和酸性尾端组成的融合分子制备 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 HMGB1 A box 和酸性尾端组成的融合分子抗炎功能的鉴定与比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验三 HMGB1 A box 和酸性尾端组成的融合分子抗菌功能的鉴定与比较 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验四 盐酸青藤碱抑制基础水平和LPS 诱导的HMGB1 表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验五 盐酸青藤碱抑制HMGB1 基因启动子活性 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 高迁移率族蛋白B1(HMGB1)研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表(或待发表)论文 |
| 英文论着一 |
| 英文论着二 |
（7）Endocan可溶性表达和纯化及其转染MDCK细胞对OPN表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 Endocan 原核表达载体的构建、表达及初步纯化 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组 Endocan 转染 MDCK 细胞对其表达 OPN 的影响 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 对课题第一部分的进一步设想 |
| 对课题第二部分的进一步设想 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 单链抗体的研究进展及其应用 |
| 1 单链抗体的结构 |
| 2 单链抗体的特点 |
| 3 单链抗体基因的来源和构建 |
| 4 表达 |
| 5 单链抗体活性的测定 |
| 6 单链抗体的应用 |
| 7 ScFv 存在问题及改进 |
| 8 单链抗体的应用前景和展望 |
| 第二章 细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的研究进展 |
| 1 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的生物学特点 |
| 2 ICAM-1 的功能 |
| 3 ICAM-1 与临床上疾病的关系 |
| 4 抗黏附治疗 |
| 5 展望 |
| 第三章 包涵体柱色谱复性研究进展 |
| 1 包涵体特点及形成 |
| 2 包涵体的复性 |
| 3 包涵体的色谱复性 |
| 4 影响色谱复性的因素 |
| 5 复性蛋白质的检测 |
| 6 展望 |
| 第二篇 实验内容 |
| 第一章 抗ICAM-1 单链抗体原核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗ICAM-1 单链抗体的原核表达、表达条件的优化及工程菌的发酵工艺研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗ICAM-1 单链抗体的纯化及复性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 抗ICAM-1 单链抗体蛋白的生物学活性研究.. |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）小鼠血吸虫病肝组织中内皮细胞特异性分子-1的表达及黄芪总苷对其影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 中文摘要 英文摘要 小鼠血吸虫病肝组织中ESM-1的表达及黄芪总苷对其影响 1 |
| 前言 2 |
| 材料与方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 5 |
| 结论 6 |
| 小结 7 |
| 参考文献 附录 致谢 综述 参考文献 |
四、人内皮细胞特异性分子-1表达载体的构建、体外表达及初步纯化（论文参考文献）
- [1]ESM1在三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭中的作用及机制研究[D]. 杨阳. 华中农业大学, 2020(02)
- [2]GATA5基因启动子在急性心肌梗死患者中的分子遗传学研究[D]. 宋志鹏. 山东大学, 2020(02)
- [3]CSP Ⅰ-plus修饰的内皮抑制素抑制肝细胞癌转移的初步研究[D]. 张晶晶. 广东药科大学, 2019(02)
- [4]PurC影响马链球菌兽疫亚种致脑膜炎的作用机制[D]. 彭婕. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]牙龈素对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞的作用及增殖调控研究[D]. 曹冲. 新疆医科大学, 2017(05)
- [6]HMGB1酸性尾端抗菌相关功能位点解析及以该分子为靶点的抗炎措施研究[D]. 龚薇. 第三军医大学, 2009(03)
- [7]Endocan可溶性表达和纯化及其转染MDCK细胞对OPN表达的影响[D]. 陈孝宇. 安徽医科大学, 2009(04)
- [8]第三军医大学学报2008年第30卷总目次[J]. 栾嘉. 第三军医大学学报, 2008(24)
- [9]抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性研究[D]. 孙红. 吉林大学, 2008(11)
- [10]小鼠血吸虫病肝组织中内皮细胞特异性分子-1的表达及黄芪总苷对其影响[D]. 张岩平. 安徽医科大学, 2008(05)