一、仔猪水肿、副伤寒二联灭活菌苗的效果观察(论文文献综述)
程福亮,梁瑾,陈甜甜,宿志瑞,范群平,聂兆晶,谷巍[1](2013)在《鸡抗猪产肠毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价卵黄抗体的变化规律及喷干工艺的研究》文中认为为获得具有一定保护力的外源性抗体制剂,用于防治仔猪腹泻,利用产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)标准菌株K88、K99、987P和导致仔猪副伤寒的2株沙门菌,制备产毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价的灭活苗,免疫接种待开产母鸡400羽,聚乙二醇沉淀法分离纯化卵黄抗体,然后采用直接试管凝集法检测不同时间的卵黄抗体(IgY)效价。将试验结束后无菌收集的全蛋液稀释过滤后,按照喷干设备进口温度165℃,出口温度85℃进行喷雾干燥,制备卵黄抗体粉,并对其进行表观性状及相关指标的测定。结果表明,免疫接种蛋鸡后,卵黄液中抗体IgY的效价呈现规律性变化,喷雾干燥获得的卵黄抗体粉表观性状较好,粗蛋白含量为12.6%,体外消化率高达95%,IgY的效价为1∶29。通过3次免疫接种获得了高免卵黄抗体,并进行了全蛋喷雾干燥工艺的摸索,制备出了效价较高的抗体制剂,为预防和治疗仔猪腹泻提供了一条途径。
赵继红[2](2012)在《仔猪水肿病的综合防治措施》文中进行了进一步梳理仔猪水肿病最早发现于英国,是由溶血性大肠埃希氏菌引起的一种断奶后仔猪急性、高度致死性疾病。近年来,随着畜牧业的发展,仔猪水肿病的发生日益增多,在各地呈上升趋势,已成为猪的常见病和多发病,更是早期断奶后仔猪死亡的主要原因,给养猪业造成了重大的经济损失。因此,及早确诊本病并采取有效的针对性综合性
刘丽萍,王守君,单艳君,朱永信,张玲,张谦[3](2011)在《猪高热病的诊断与防治》文中认为猪高热病是由高致病性蓝耳病等病毒和细菌、寄生虫等多种病原混合或继发感染引起的急性、热性、高致病性和致死性的传染性疾病。近年来,猪高热病在不少地方经常发生,尤其是高温高湿夏季。
满晓营[4](2009)在《猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究》文中认为猪水肿病是由特定血清型产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichiacoli,SLTEC)引起猪的一种急性、致死性传染病,发病率低,但病死率高,幸存者发育迟缓,饲料回报率低,给养猪业带来很大的经济损失。猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原,过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一,现在在我国特别是农村散养户普遍存在,造成一定经济损失。产类志贺毒素大肠杆菌的两个主要毒力因子是F18ab菌毛与类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)。编码F18ab的基因有6个:fedA、fedB、fedC、fedD、fedE和fedF。Smeds A等(2001)利用融合蛋白对F18菌毛粘附特性作了进一步的研究,表明纯化的FedF与细菌的粘附相关。SLT-Ⅱe毒素是由一个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。SLT-Ⅱe的B亚基没有毒性,而具有免疫原性,是水肿病毒素的主要保护性抗原。沙门氏菌作为疫苗活载体己受到学界的广泛重视,其主要优点包括沙门氏菌可以经口服或鼻内途径免疫,操作方便,对接种对象应激小。此外,沙门氏菌为胞内侵袭细菌,可以有效呈递抗原,并激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。基于以上原因,希望构建以沙门氏菌作为载体表达融合基因SLT-ⅡeB与FedF,得到一种疫苗可以同时预防仔猪水肿病和沙门氏菌病。主要研究内容包括:1、重组质粒pYA-SF的构建参照GenBank中大肠杆菌EC0412A株SLT-ⅡeB和FedF序列设计引物,以WH3基因组为模板扩增并克隆SLT-ⅡeB与FedF基因,扩增片段大小为204bp和840bp,前者引物引入EcoRI和SalⅠ酶切位点,后者引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点。回收PCR产物,连接pMD18-T,得到质粒pMD18-SLT-ⅡeB-FedF,用EcoRⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD-SLT-ⅡeB-FedF和pYA3493双酶切,回收、连接、转化Asd-大肠杆菌x6097,得到质粒pYA-SLT-ⅡeB-FedF(缩写为pYA-SF)。2、重组菌株C501(pYA-SF)的构建与鉴定将重组平衡表达质粒pYA-SF电转化△asdC500缺失株,在无DAP的LB平板上筛选阳性重组子。用引物pa7/pa6对重组菌株进行鉴定,可以扩增出△asd缺失型菌株的2,229 bp片段,而亲本菌C500则扩增出4,000 bp的片段;引物ps1/ps2扩增出SLT-ⅡeB特异性片段204 bp,引物pf1/pf2扩增出FedF特异性片段840 bp,而亲本菌C500则不能扩增出该两种片段。结果表明获得含有pYA-SF质粒的重组菌株是正确的。3、重组菌株生物学特性的研究表型研究与生化特性研究表明重组菌株C501(pYA-SF)与亲本株C500相同。生长曲线得出C501(pYA-SF)生长速度与亲本菌株C500相似,而比C500缺失菌株△asdC500(pYA3493)的生长速度稍快。遗传特性研究表明重组菌株可以稳定遗传。SDS-PAGE结果显示,重组菌株可以分泌表达,因为重组菌株C501(pYA-SLT-ⅡeB-FedF)在约37kDa处有明显的表达带,而空载体对照菌株C501(pYA3493)则没有对应的表达带。4、基因工程疫苗对小鼠的免疫保护效力研究皮下免疫小鼠,每周采集小鼠血清,利用间接ELISA检测所有免疫组的IgG抗体,结果表明针对相应抗原的抗体相应增加,加强免疫后抗体平均水平进一步提高。小鼠免疫后30天,分别用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(1×107.1 CFU)口服攻毒和猪水肿病大肠杆菌强毒株WH3(5×108 CFU)腹腔攻毒,亲本菌株C500组和重组菌株免疫组小鼠抵抗10×LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的攻击,而PBS对照组小鼠全部死亡,然而重组菌株免疫组和水肿病三价灭活苗组对2.5×LD50大肠杆菌强毒株WH3的攻击差别比较大,重组菌株免疫组只能提供43%的保护率,灭活苗组却能提供89%的保护率,同期的PBS对照组小鼠全部死亡。5、基因工程疫苗对猪的免疫保护力研究重组菌株的安全性试验结果发现所有C500(pYA-SF)肌肉注射接种组仔猪的精神食欲正常,未见异常变化。亲本菌株C500接种的仔猪,也没有异常临床表现。将6×109 CFU重组菌株C501(pYA-SF)分别通过肌肉注射途径免疫20日龄仔猪,结果显示免疫仔猪能产生较高水平的抗沙门氏菌和SLTEC重组蛋白rSF的血清IgG,并能抵抗5×LD50猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的耳静脉攻击(4/4)。同时,免疫仔猪也能抵抗SLTEC强毒株WH3分泌毒素的耳静脉攻毒途径的攻击(3/4),而PBS组(0/4)和C501(pYA3493)载体对照组(1/4)均不能提供有效保护。说明研究构建的猪水肿病与仔猪副伤寒重组二价活疫苗株C501(pYA-SF)能保护免疫仔猪抵抗猪霍乱沙门氏菌和SLTEC的攻击,有望成为实用有效的二价活疫苗株。
韩国全[5](2009)在《含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用》文中提出为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技术从猪霍乱沙门菌疫苗株S.C500基因组DNA中扩增出启动子PnirB、PpagC基因区域片段,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组质粒pUCX-PnirB、pUCX-PpagC。序列分析结果显示启动子PnirB、PpagC与其它沙门菌相关序列核苷酸同源性较高,分别为96%~100%、93%~99%,其中与霍乱沙门菌SC-B67核苷酸同源性分别高达100%、99%,说明两启动子基因区域高度保守。生物信息学网络软件NNPP分析结果显示,PnirB启动子基因区域序列有3个较强的启动子Promotor序列,PpagC启动子基因序列有12个较强的启动子Promotor序列,说明试验所扩增的两个基因启动子区域片段具有启动基因表达的基本元件。Ⅱ.沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究为考察沙门菌启动子的启动表达能力及特点,运用基因工程技术构建携带有沙门菌内源性启动子PnirB、Ppagc的单一启动子表达载体pPB、pPC,进一步构建其报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP,并转化到S.C500中进行相应的诱导性表达。通过表达菌液荧光观察、菌细胞表达荧光检测、SDS-PAGE检测,确证EGFP的获得成功表达,证实克隆获得的启动子PnirB、PpagC区域基因片段在S.C500中具有启动活性。Ⅲ.新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建及表达活性研究为研制含沙门菌内源启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,利用PCR技术亚克隆启动子必需区域基因片段PnirB(CB)(190bp)、PpagC(CC)(490bp),并设计添加SD-Kozak杂合序列,替换pCI-neo启动子Pcmv下游的Chimeric intron基因区域,构建双功能疫苗表达载体pCB-neo、pCC-neo。进一步构建报告基因载体pCB-EGFP、pCC-EGFP。实现EGFP在S.C500中表达,证实PnirB(CB)、PpagC(CC)可以在S.C500中驱动外源基因的表达;实现EGFP在Vero细胞中表达,证实原载体中启动子Pcmv可以在Vero中驱动外源基因的表达,说明下游新插入的启动子不影响其启动活性:实现EGFP在小鼠体外培养巨噬细胞中表达,进一步证实S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo为表达载体构建的新型基因疫苗的可行性。Ⅳ.内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究为获得内江猪白细胞介素15基因序列片段,利用RT-PCR技术从经由Con A刺激的内江猪PMBC扩增了pIL-15基因,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组克隆质粒pUCX-njpIL-15。构建原核表达载体pMAL-pmIL-15,实现pIL-15在大肠杆菌中高效表达。MTT法试验显示融合产物MBP-pmIL-15经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖。构建真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合肌注免疫BALB/c雌性小鼠试验显示,pCI-pIL15能够促进小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞数量增殖,加强基因疫苗pCI-gD(PRV)特异性中和抗体的产生:试验证实内江猪IL-15具有免疫佐剂作用。Ⅴ.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的分子克隆与原核表达研究为获CSFV-E2基因片段,利用RT-PCR技术从PK-15细胞增殖的CSFV四川分离株中成功分子克隆E2基因,含有编码E2蛋白完整基因序列,共1119 bp,编码373 aa。构建原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe),转化到宿主菌E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS进行表达研究,SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析结果显示,试验成功表达的mE2(pe)、E2(pe)均具有一定的生物学免疫反应活性。CSFV-E2主要抗原位点区域(mE2)的成功原核表达,为进一步研究新型猪瘟病毒基因疫苗奠定理论基础。Ⅵ.猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究运用分子生物学实验技术将内江猪IL-15成熟肽基因与CSFV-E2主要抗原位点区域基因有机连接,构建融合双基因的克隆重组质粒pUCX-ME2-IL-15。构建真核表达载体pEGFP-ME2-IL-15,转染到Vero细胞中,荧光检测证实表达出增强型绿色荧光蛋白融合蛋白,证实试验构建的目的融合双基因ME2-IL-15可以在真核Vero细胞中获得表达,为进一步研究融合双基因ME2-IL-15奠定理论基础。构建融合双功能重组表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照真核重组表达载体pCI-ME2-IL-15,分别将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15转化到S.C500,SDS-PAGE电泳及Western-blott检测显示融合双基因ME2-IL-15在S.C500中成功表达,证实PnirB(CB)、PpagC(CC)可以在S.C500中驱动融合双基因ME2-IL-15的表达:将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15转染到哺乳动物Vero细胞中,mRNA转录、间接免疫荧光及夹心ELISA检测结果证实Pcmv可以在Vero中驱动外源基因ME2-IL-15的表达。为进一步研究S.C500运载双基因融合表达基因疫苗奠定试验基础。Ⅶ.融合双基因疫苗在S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力影响的研究为了考察融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力的影响,试验对构建的重组工程活菌苗进行系统研究。结果显示,双功能表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照pCI-ME2-IL-15存在与否不影响运载菌S.C500的生物学特性,对其生化鉴定特性亦不影响,除Amp抗性外,重组菌与运载菌的药敏性一致;基因疫苗表达载体所插入的融合双基因ME2-IL-15增加其在运载菌S.C500体内的稳定性;基因疫苗的存在使运载菌S.C500对ST细胞的粘附能力、侵袭能力及其在ST细胞体内的增殖能力均有一定程度的下降,对运载菌本身的免疫效应有一定影响;口服免疫28日龄BALB/c雌性小鼠具有一定的稳定性和免疫安全性,可以有效的将基因疫苗运载至免疫小鼠机体细胞;为研究S.C500运载基因疫苗的免疫应答奠定前提。Ⅷ.融合双基因疫苗重组S.C500活菌苗口服接种家兔的免疫应答初步研究为检测家兔血清中S.C500抗体水平,建立猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法,确立抗原最佳包被浓度为0.305μg/mL,血清最适稀释度为1:40,试验测定血清样品的D492 nm值,判定标准通过标准阴性血清按照P/N比值公式进行判断,P/N≥2.1为阳性,1.5<P/N≤2.1为可疑,1.5<P/N为阴性;可以间接反应抗体水平的高低。家兔血清CSFV抗体检测结果显示对照A组(口服PBS缓冲液对照)无CSFV抗体,B组(口服S.C500/pCB-ME2-IL-15)、C组(口服S.C500/pCC-ME2-IL-15)、D组(口服S.C500/pCI-ME2-IL-15)、E组(口服S.C500/pCI-ME2)首免后14天即已产生CSFV抗体,第二、三次均呈上升趋势,B、C组免疫效果优于D、E组,B、C组之间相比C组免疫效果稍好,D、E组之间相比D组免疫效果稍好,试验研制的双功能疫苗通用表达载体pCB-neo、pCC-neo具有一定优势;S.C500抗体检测结果显示,试验构建的四个重组工程菌组经灌服均产生了较高的抗体水平,对照灌服PBS缓冲液组未能检测到抗S.C500特异性抗体的存在。免疫家兔T淋巴细胞增殖检测分析显示,对照A组家兔三次T淋巴细胞增殖率均低于15%,之间差异亦不大;B、C、D、E四个口服免疫组T淋巴细胞增殖率均高于18%以上,末次免疫后14d,B组增殖率有小幅度下降,C、D、E三组增殖率均有不同程度的增强提高。于末次免疫后14d,用4头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗肌肉注射进行攻毒,以热反应为判定标准,保护率依次为0%、40%、60%、40%、25%,说明S.C500为运载体的猪瘟基因疫苗能够诱导家兔产生一定抗CSFV的保护性特异抗体,其中试验研制的基因疫苗通用表达pCC-neo携带的抗原基因保护率较高,具有一定优势。采用4×1010 CFU/只剂量的猪伤寒沙门菌野毒株口服接种攻毒试验,结果表明试验所构建的四个重组工程菌均能够诱导家兔产生一定水平的抗猪伤寒沙门菌野毒株的保护性特异抗体。
赵战勤[6](2008)在《支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究》文中进行了进一步梳理支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR),也是猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory diseasecomplex,PRDC)的重要致病因子之一。更重要的是,Bb的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度,造成严重经济损失。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家,已成为猪的重要呼吸道传染病之一。本研究对Bb的病原流行病学、生物学特性、免疫原性基因、诊断方法和重组沙门氏菌基因工程疫苗进行研究,为我国Bb的流行病学分布提供理论依据,为猪波氏菌病的临床诊断、预防与控制提供新方法。主要研究内容如下:1.Bb的分离鉴定与病原流行病学研究从全国十五个省市送检的2,057份有肺炎或AR症状猪的肺脏等病料组织中分离出190株Bb和不同数量的共感染菌。2003~2006年间的Bb总分离率为9.2%;不同省份Bb的总分离率介于7.5~14.1%之间;不同年份Bb的总分离率介于7.3~11.8%之间;Bb的分离率与猪日龄有一定关系。Bb最常见的共感染菌依次是链球菌(55.9%)、副猪嗜血杆菌(50.0%)、大肠杆菌(43.1%)、巴氏杆菌(25.5%)和绿脓杆菌(17.6%)。在43份有典型AR症状猪的病料中,分离出22株Bb、7株产毒素巴氏杆菌和6株绿脓杆菌;在分离出产毒素巴氏杆菌的7份病料中均同时分离出Bb,而其中6份又同时分离出绿脓杆菌。研究结果表明,Bb在我国猪群的感染十分普遍,Bb与其它病原菌的共感染情况非常严重,且在AR的发生中具有重要作用。2.Bb的生长特性及强毒菌株的筛选Bb在多种培养基中均生长良好,但加血液的鲍-姜氏培养基更易于BbⅠ相菌形态的维持,且在含绵羊血的鲍-姜氏培养基上产生更明显的β-溶血环。小鼠致死性试验结果表明Bb毒力普遍较弱,但少数菌株如1562、3331、HH0809等表现出很强的毒力。以HH0809株为出发菌株分别建立小鼠和仔猪的呼吸道感染模型。采用建立的感染模型测定HH0809株对小鼠的LD50(the 50%lethal dose)为1.4×105 CFU,对猪的LD50为2.0×1010 CFU,详细记录了感染小鼠和感染仔猪的症状和病理变化。Bb生长特性研究以及小鼠和仔猪的呼吸道感染模型的建立为猪波氏菌病快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定基础。3.Bb保护性抗原基因的筛选以强毒菌株HH0809的基因组为模板,分段克隆表达Bb重要的保护性抗原丝状血凝素基因fhaB(6,260 bp)和百日咳杆菌粘附素基因prn(2040 bp)。fhaB基因分为5段,从N端到C端分别命名为F5(1,400 bp)、F4(1,200 bp)、F3(1,200 bp)、F2(1,800bp)和F1(660 bp);prn基因分为2段,从N端到C端分别命名为P1(1,190 bp)和P2(850 bp),以及prn基因全段(2,040 bp);将8段DNA片段分别克隆到pGEX-KG表达载体并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,纯化包涵体后使用30μg(与等体积弗氏完全佐剂混合)免疫BALB/c小鼠,于21 d后使用4×LD50的Bb强毒株HH0809进行呼吸道的气雾攻毒。结果表明:fhaB基因各片段表达产物GST-F1、GST-F2、GST-F3、GST-F4和GST-F5免疫组小鼠的存活率分别为66.7%(6/9)、0(0/9)、0(0/9)、44.4%(4/9)和11.1%(1/9);prn基因各片段表达产物GST-P1、GST-P2和GST-PRN免疫组小鼠的存活率分别为88.9%(8/9)、100%(9/9)和100%(9/9)。小鼠保护力试验结果证实FHA和PRN均是Bb重要的保护性抗原成分。其中,FHA的C端F1片段(TypeⅠdomain)和PRN的P2段(RegionⅡdomain)分别为两种抗原最重要的免疫保护性抗原区域,有望作为波氏菌病的诊断抗原和新型疫苗的成分。4.Bb抗体检测ELISA方法的建立与应用利用已纯化的各段表达蛋白GST-F5、GST-F4、GST-F3、GST-F2、GST-F1、GST-P1、GST-P2和GST-PRN分别进行间接ELISA检测方法研究。结果显示,作为包被抗原,GST-PRN优于其它各段蛋白。进一步通过凝血酶Thrombin酶切GST-PRN并回收,获得纯的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,PRN-ELISA方法特异性良好,该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性;ELISA方法能够检测到人工感染仔猪14 d的血清抗体IgG,比乳胶凝集方法高4~128倍,但与其符合率为100%;用该ELISA方法检测2005~2007年间来自全国各地的1,229份猪血清样本,阳性率为32.7%。该方法对2个阳性猪场的检测结果表明保育期仔猪的合群导致猪群大量感染Bb。5.表达Bb保护性抗原的重组沙门氏菌株的构建及生物学特性将fhaB F1段和prn P2段依次与pMD18-T载体连接,然后将F1-P2融合片段转移连入沙门氏菌asd平衡表达质粒pYA3493中,制备重组平衡表达质粒pYA-F1P2。将pYA-F1P2和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd缺失株C501中,制备重组菌株C501(pYA-F1P2)和空载体菌株C501(pYA3493)。研究结果表明,重组菌株C501(pYA-F1P2)保留了亲本菌株C500的生化特性和抗原表型,能稳定遗传并高效分泌表达Bb的rF1P2抗原;C501(pYA-F1P2)的毒力较亲本菌C500降低了4.5倍。将C501(pYA-F1P2)分别高剂量接种仔猪和怀孕母猪观察其作为重组疫苗的安全性。结果表明,该重组菌株和亲本菌株C500接种的仔猪均没有异常临床表现;该重组菌株和亲本菌株C500接种的怀孕母猪也没有异常临床表现,与没做任何处理的对照组怀孕母猪所产仔数没有差异。猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是我国广泛使用的预防仔猪副伤寒的标准疫苗株。本研究利用猪霍乱沙门氏菌C500弱毒疫苗株的asd基因缺失株构建平衡载体表达系统菌株C501(pYA-F1P2)能高效分泌表达Bb免疫原性重组抗原蛋白;该活疫苗株C501(pYA-F1P2)的毒力较亲本菌株C500稍低,对断奶仔猪和怀孕母猪均是安全的,有望成为新型猪波氏菌病-副伤寒二价活疫苗的候选菌株。6.支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究利用表达Bb免疫原性基因F1(fhaB的TypeⅠ)片段和prn基因的P2(prn的Region 2)片段重组猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C501(pYA-F1P2),制备支气管败血波氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗,检验该重组活疫苗对免疫BALB/c小鼠和猪针对猪霍乱沙门氏菌和Bb攻击的保护效力。将2.1×109 CFU和2.1×108 CFU重组菌株C501(pYA-F1P2)分别通过口服和皮下注射途径免疫BALB/c小鼠,结果显示两种免疫方法均能产生较高水平的血清IgG,并保护小鼠抵抗10×LD50猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的口服攻击(4/4)。但使用4×LD50 Bb强毒株HH0809进行呼吸道气雾攻毒后,口服免疫不能提供有效保护(4/22),而皮下免疫能够提供完全保护(22/22)。进一步检测结果表明,皮下免疫能产生较高水平的肺脏IgG,口服免疫则不能。同时,皮下免疫重组蛋白HIS-F1P2的小鼠也能完全抵抗4×LD50 Bb强毒株HH0809的攻击。将1.2×1010 CFU重组菌株C501(pYA-F1P2)通过颈部肌肉注射免疫20日龄仔猪,结果显示免疫仔猪能产生较高水平的针对沙门氏菌和Bb重组蛋白rF1P2的血清IgG,并能抵抗5×LD(Lethal dose)猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的口服攻击(4/4)。同时,免疫仔猪也能抵抗4×LD50 Bb强毒株HH0809呼吸道途径的攻击(4/4),而PBS组(0/4)和C501(pYA3493)载体对照组(1/4)均不能提供有效保护。另外,重组菌株C501(pYA-F1P2)组诱导仔猪抵抗Bb攻击的保护力优于重组蛋白HIS-F1P2。该研究构建的支气管败血波氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗菌株C501(pYA-F1P2)能保护免疫仔猪完全抵抗猪霍乱沙门氏菌和Bb的致死性攻击,有望成为实用有效的新型双价基因工程活疫苗。
刘国平[7](2007)在《猪水肿病基因工程亚单位菌苗及F18~+E. coli的病原学研究》文中提出F18+E.coli是引起猪水肿病(Eedema disease of swine,ED)及大肠杆菌性断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea,PWD)的重要病原,猪水肿病及大肠杆菌性断奶仔猪腹泻是一种世界范围内广泛存在的并造成断奶仔猪死亡的重要疾病。应用疫苗免疫以及对猪群的F18+E. coli血清学检测是预防和控制该病的关键,然而到目前为止,市面上还没有商品化的疫苗及血清学检测方法。本研究开展了对F18+ E. coli的病原分离鉴定、主要毒力基因分析、检测方法的建立和基因工程亚单位疫苗及亚单位菌苗的研究,主要研究内容如下:1.F18+ E. coli的分离鉴定及Ee株的主要毒力基因的序列分析利用FedA-PCR及凝集试验,从临床分离的284株大肠杆菌中检测出12株F18+E. coli,同时,从130份健康育肥猪肛拭子样本中分离、筛选检测出24株F18+ E. coli。利用标准血清对分离的36株菌株进行O抗原血清分型,分离株分为17种血清型,其中O8占8.3%(3/36)、O138占8.3%(3/36)、O101占8.3%(3/36)及O9占5.6%(2/36)。耐药性检测显示36株分离菌对14种药物表现出不同的耐药性,6耐以上的菌株占74.6%(27/36),其中最多为10耐(6/36,占17.4%)。我们对分离于湖北武汉的一株强毒株(Ee株)的主要毒力基因(SLT-IIeB、SLT-IIeA、FedF及FedA)进行了克隆与序列分析,并与国际标准株E. coli S1191相应核苷酸序列进行了比较。2.FedF-ELISA的建立及应用在将Ee株黏附素FedF融合表达以及重组蛋白GST-FedF纯化的基础上,利用F纯化蛋白包被ELISA板,建立了F18+ E. coli抗体的ELISA检测方法。对90份阴性血清进行检测,确定该方法的阴阳性临界值为0.381。将该方法与细菌分离鉴定进行了比较,结果二者的总的符合率为92.8%。对灭活菌苗免疫猪免疫血清及F18+ E. coli感染猪感染血清检测结果显示仔猪感染或接种疫苗后分别为1周或2到3周后出现抗体。利用FedF-ELISA检测方法对来自24个猪场1421份临床送检血清进行检测,测得F18+ E. coli的血清学阳性率为30.4%(432/1421)。利用该检测方法对来自健康猪群2593份血清进行了检测,数据表明F18+ E. coli的感染在健康猪群都存在;总的阳性率依次为母猪46.36%(159/343),初生猪40.4%(324/750),保育猪15.73%(118/750),及育肥猪26.0%(185/750)。进一步统计学分析表明不同猪场以及不同猪群的F18+ E. coli的血清学阳性率差异显着,而且母猪F18+ E. coli血清学阳性率与猪场的血清学阳性率存在正相关。3.SLT-IIeB与FedF融合蛋白对小鼠的免疫原性根据猪水肿病大肠杆菌Ee株主要免疫原性片段SLT-IIeB和FedF的基因序列,利用PCR技术克隆目的片段,并将SLT-IIeB和FedF基因依序串联于谷胱甘肽—S—转移酶(GST)表达系统的GST下游,在大肠杆菌中成功获得了大小约为62kDa融合蛋白GST-SF,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的免疫反应活性。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰兔制备血清,血清体外活性试验表明,所制备的抗血清能中和Ee株水肿毒素对Vero细胞的病变效应;黏附抑制试验证实抗血清能抑制Ee株对猪小肠刷状缘细胞的黏附。将融合蛋白免疫小鼠,并以SLT-IIeB和FedF蛋白为对照。结果表明,融合表达策略能提高SLT-IIeB和FedF各自的免疫原性,能够诱发较好的免疫反应,并能提供对Ee株5LD50致死剂量的70%保护率。4.亚单位菌苗对小鼠的保护效力利用大肠杆菌表达猪水肿病大肠杆菌的水肿毒素SLT-IIeB与F18菌毛黏附素FedF融合蛋白,将表达蛋白纯化并复性,再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株(O139),和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗,免疫昆明鼠,间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素及黏附素的ELISA抗体和Ee株的菌体凝集效价,第2次免疫3周后用5LD50的猪水肿病大肠杆菌Ee株进行攻毒。结果亚单位菌苗组与灭活菌苗组ELISA抗体水平有显着性差异,两种疫苗对Ee的保护力分别为90%和70%。结果表明新型亚单位菌苗对强毒株攻毒具有较好的保护力。5.亚单位菌苗对仔猪的保护效力利用大肠杆菌表达大肠杆菌Ee株的水肿毒素B亚单位SLT-IIeB与F18菌毛黏附素FedF融合蛋白,将重组蛋白纯化并复性,再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株(O139),和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗,间隔三周两次免疫仔猪。利用ELISA检测针对SLT-IIeB与FedF的抗体,利用微量凝集试验检测菌体抗体凝集效价;利用商品化试剂盒对攻毒后72h血清中生化指标进行检测;对存活猪进行日增重测定;保留死亡猪病理组织,两周后剖杀存活猪并保留组织,进行病理学检验。二次免疫3周后经前腔静脉以160×109CFU的Ee株进行攻毒。结果显示亚单位菌苗组具有较高的毒素抗体、菌体凝集效价、日增重、较高的保护效率以及较低的组织病理学积分。总之亚单位菌苗无论是保护效率、抗体水平、日增重还是在减轻临床病理变化上都优于常规灭活苗。
孙秉睿[8](2006)在《仔猪水肿病的防治》文中研究指明
徐引弟[9](2006)在《猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用》文中指出猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原,过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一,现在在我国特别是农村散养户普遍存在,造成一定经济损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染,可使人发生食物中毒,因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。疫苗接种是控制猪霍乱的最适宜手段。猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但具有一定的残余毒力,遗传背景不清,且存在毒力返强的风险。 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的主要方向。沙门氏菌作为疫苗载体已受到医学与兽医学的广泛重视,其主要优点包括沙门氏菌可以经粘膜途径免疫(口服或鼻内),操作方便,对接种对象刺激小。此外,沙门氏菌为胞内侵袭细菌,能有效呈递抗原,激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。但目前所构建的沙门氏菌载体多为鼠伤寒沙门氏菌。以猪霍乱沙门氏菌为载体的报道很少。而猪水肿病(Edema disease of swine,ED)是由某些血清型的E.coli引起的,主要发生在断乳后1—2周的仔猪,是危害断奶仔猪较严重的疾病之一。SLT—Ⅱv毒素是致水肿病的主要致病因子,由1个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。A亚基为毒素的毒力部分,B亚单位决定毒素的特异性,也是毒素的主要免疫原性部分。 基于以上考虑,本研究旨在研制更加安全的猪霍乱沙门氏菌弱毒株,并将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体。以C500为亲本菌,在基因组上缺失编码cAMP受体蛋白的crp(cAMP receptor protein)基因,以降低C500毒力,消除毒力返强的风险。进一步缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的asd(aspartate beta-semialdehyde)基因,构建asd平衡致死系统,用于高效表达外源基因,初步应用该载体表达了绿荧光蛋白基因(Green fluorescence protein,gfp)和致水肿大肠杆菌水肿毒素B亚基(Shiga-like toxin type Ⅱ variant B,SLT-ⅡvB),并进行了小鼠免疫试验,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括: 1.crp、asd基因的克隆与重组自杀性质粒的构建 参照GenBank中鼠伤寒沙门氏菌LT2株crp及asd序列,以C500基因组为模板扩增并克隆crp与asd基因。测序及序列比对分析证实,两基因与已发表的其它3株沙门氏菌crp、asd基因全序列高度同源。从C500基因组中扩增crp及asd上下游片断,连接到自杀性质粒pRE112上,分别构建了缺失320bp的crp基因缺失320bp,插入gfp的crp缺失,以及缺失1408bp的asd基因缺失1408bp,并携带蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp和pREasd。 2.接合转移与C500crp-、C500crp-/gfp+、C500crp-/asd-、C500crp-/gfp+/asd-、C500asd-缺失株的筛选鉴定
闫祖书[10](2004)在《仔猪水肿病病原分离鉴定及免疫防制研究》文中认为从陕西省的汉中、咸阳、宝鸡等地疑似猪水肿病的病、死猪体内分离到16株细菌,根据其形态、培养特性和生化特性鉴定为大肠杆菌。动物致病力试验表明,其中12株为致病性大肠杆菌,能致死小鼠。血清学鉴定出O139、O8、O2、O141共4种血清型,其中O139和O8为优势血清型。用分离的猪水肿病大肠杆菌优势血清型与标准菌株制备出多价灭活苗,免疫仔猪后有很好的保护效果,临床调查显示保护率达99%以上。免疫猪群每隔1周随机采血,仔猪在注苗后7d凝集抗体阳性率达100%。免疫后14d凝集抗体滴度可达高峰,抗体阳性率至少维持6周以上。实验表明,免疫猪血清大肠杆菌凝集抗体水平与其保护力呈正相关,水肿病多价大肠杆菌灭活苗免疫仔猪,效果可靠。
二、仔猪水肿、副伤寒二联灭活菌苗的效果观察(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、仔猪水肿、副伤寒二联灭活菌苗的效果观察(论文提纲范文)
(1)鸡抗猪产肠毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价卵黄抗体的变化规律及喷干工艺的研究(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 菌株菌株 |
1.1.2 培养基 |
1.1.3 免疫佐剂 |
1.1.4 试验用动物 |
1.1.5 试验地点 |
1.2 方法 |
1.2.1 细菌繁殖 |
1.2.2 活菌计数 |
1.2.3 免疫原的制备 |
1.2.3.1 菌悬液的制备 |
1.2.3.2 无菌检验 |
1.2.4 灭活菌苗的制备 |
1.2.4.1 油相的制备 |
1.2.4.2 水相的制备 |
1.2.4.3 菌悬液水相、油相比例和硬脂酸铝添加量的优化 |
1.2.4.4 灭活苗的制备 |
1.2.5 灭活苗的检测 |
1.2.5.1 性状检测 |
1.2.5.2 安全检验 |
1.2.6 高免卵黄抗体的制备 |
1.2.6.1 蛋鸡饲养与免疫接种 |
1.2.6.2 高免卵黄抗体的分离纯化 |
1.2.6.3 直接试管凝集法效价检测 |
1.2.6.4 效价判定标准 |
1.2.7 卵黄抗体液的喷雾干燥 |
1.2.8 卵黄抗体粉相关营养指标的测定 |
1.2.8.1 粗蛋白的测定 |
1.2.8.2 单一胃蛋白酶消化率的测定 |
1.2.8.3 全蛋粉中卵黄抗体效价的测定 |
2 结果 |
2.1 菌悬液水相与油相比例以及硬脂酸铝添加量的优化 |
2.2 灭活疫苗的制备 |
2.3 无菌检验 |
2.4 性状检验 |
2.5 安全性检验 |
2.6 卵黄抗体效价的总体变化情况 |
2.7 卵黄抗体粉喷雾干燥工艺的初步摸索 |
2.7.1 卵黄粉营养指标的测定 |
2.7.2 全蛋粉中卵黄抗体效价的测定 |
3 讨论 |
(2)仔猪水肿病的综合防治措施(论文提纲范文)
1 流行特点及病因 |
2 临床症状 |
3 病理变化 |
4 诊断 |
5 防治措施 |
5.1 减轻仔猪断奶后营养应激的影响 |
5.2 降低仔猪饲料中的蛋白质含量 |
5.3 应用酸化剂 |
5.4 补铁 |
5.5 补硒 |
5.6 药物预防 |
5.7 疫苗预防 |
5.8 断奶前后驱虫 |
5.9 消灭传染源 |
5.1 0 水肿病的治疗 |
5.1 0. 1 控制全身症状: |
5.1 0. 2 巩固预防: |
6 讨论 |
(3)猪高热病的诊断与防治(论文提纲范文)
1 流行特点 |
2 临床症状 |
3 剖检变化 |
4 预防措施 |
5 治疗方案 |
(4)猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词(ABBREVIATION) |
1 文献综述 |
1.1 猪水肿病的研究进展 |
1.1.1 猪水肿病的病原学 |
1.1.2 猪水肿病的毒力因子 |
1.1.3 猪水肿病的致病机理 |
1.1.4 猪水肿病的影响因素 |
1.1.5 猪水肿病的诊断 |
1.1.6 猪水肿病的免疫研究 |
1.2 猪沙门氏菌病的研究进展 |
1.2.1 猪沙门氏菌病及其危害 |
1.2.2 猪霍乱沙门氏菌的特征 |
1.2.3 沙门氏菌病的诊断 |
1.2.4 防治策略 |
1.2.5 沙门氏菌疫苗研究进展 |
1.3 弱毒沙门氏菌载体的研究进展 |
1.3.1 弱毒沙门氏菌载体的优点 |
1.3.2 弱毒沙门氏菌载体的缺点及改进方法 |
1.3.3 沙门氏菌载体的应用 |
2 目的与意义 |
3 材料与方法 |
3.1 材料 |
3.2 方法 |
3.2.1 质粒的制备 |
3.2.2 沙门氏菌电转化 |
3.2.3 沙门氏菌和大肠杆菌ELISA检测方法的建立 |
3.2.4 大肠杆菌原核表达 |
3.2.5 重组菌株的构建与鉴定 |
3.2.6 重组疫苗菌株的生物学特性研究 |
3.2.7 重组菌株的毒力试验 |
3.2.8 重组疫苗菌株对小鼠的免疫保护性试验 |
3.2.9 重组疫苗菌株对仔猪的免疫保护性试验 |
4 结果与分析 |
4.1 重组菌株的构建与鉴定 |
4.2 重组菌株的生物学特性 |
4.2.1 重组菌株的表型研究结果 |
4.2.2 重组菌株的生长特性鉴定 |
4.2.3 重组菌株的遗传稳定性 |
4.2.4 重组菌株的分泌表达 |
4.3 重组菌株的毒力试验 |
4.4 免疫小鼠的保护性试验 |
4.4.1 免疫小鼠的沙门氏菌抗体检测 |
4.4.2 免疫小鼠针对沙门氏菌攻毒的保护力 |
4.4.3 免疫小鼠针对rSF的抗体检测 |
4.4.4 免疫小鼠针对产志贺氏毒素大肠杆菌攻毒的保护力 |
4.4.5 重组疫苗的细胞因子检测 |
4.5 重组疫苗对猪的免疫效力研究 |
4.5.1 重组疫苗对猪的安全性评价 |
4.5.2 重组疫苗免疫猪只后抗体检测 |
4.5.3 重组疫苗免疫猪只后毒株攻毒保护力 |
5 讨论 |
5.1 融合基因的选择与表达 |
5.2 SLT-IIeB与FedF融合基因在Δasd C500缺失株平衡致死系统中的表达 |
5.3 重组菌Δasd C500(pYA-SF)对动物的免疫试验 |
6 结论 |
参考文献 |
致谢 |
附录 |
(5)含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
目录 |
前言 |
1 研究背景、基础和目的意义 |
2 拟解决的问题 |
3 主要研究内容 |
4 整体技术路线 |
第一部分 文献综述 |
第一章 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗运载体研究进展 |
1 沙门菌的特征 |
2 沙门菌的侵染机制 |
3 沙门菌的减毒 |
4 减毒沙门菌的胞内定位及对基因疫苗的运送 |
5 运送基因疫苗减毒沙门菌诱发机体免疫应答的机制 |
6 减毒猪霍乱沙门菌作为疫苗的应用 |
7 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的应用 |
8 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的优点及潜在的威胁 |
第二章 猪瘟病毒研究进展 |
1 猪瘟病毒概述 |
2 猪瘟病毒的病原学研究 |
3 猪瘟病毒分子生物学研究 |
4 猪瘟病毒致细胞病变型的研究 |
5 猪瘟病毒疫苗研究 |
6 猪瘟病毒与动物性食品安全 |
7 小结 |
第二部分 实验研究 |
第一章 猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物的设计与合成 |
1.2.3 S.C500细菌活化培养 |
1.2.4 S.C500细菌基因DNA的提取制备 |
1.2.5 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
1.2.6 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域扩增产物的TA克隆 |
1.2.7 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR产物的TA克隆质粒初步鉴定 |
1.2.8 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域TA克隆质粒测序鉴定 |
1.2.9 S.C500 nirB、pagC基因启动子扩增区域的序列分析 |
2 结果与分析 |
2.1 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
2.2 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列TA克隆质粒鉴定 |
2.3 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列测定及结果分析 |
2.4 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列的序列分析 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第二章 沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物设计与合成 |
1.2.3 报告基因EGFP的质粒PCR扩增及TA克隆 |
1.2.4 基因片段PnirB、PpagC的质粒PCR扩增及TA克隆 |
1.2.5 含启动子PnirB、PpagC表达载体的构建 |
1.2.6 含报告基因EGFP重组载体的构建 |
1.2.7 报告基因EGFP在S.C500中的表达研究 |
2 结果与分析 |
2.1 报告基因克隆质粒pUCX-EGFP构建 |
2.2 目的基因克隆质粒pUCX-PnirB(PB)、pUCX-PpagC(PC)构建 |
2.3 表达载体pPB、pPC构建 |
2.4 报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP构建 |
2.5 重组菌S.C500/pPB-EGFP、S.C500/pPC-EGFP的表达研究 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第三章 新型双功能通用表达载体的构建及启动活性研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物设计与合成 |
1.2.3 启动子基因PnirB(CB)、PpagC(CC)的PCR扩增及TA克隆 |
1.2.4 新型基因疫苗表达载体的构建 |
1.2.5 新型基因疫苗报告载体的构建 |
1.2.6 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
1.2.7 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中瞬时表达研究 |
1.2.8 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP的稳定性分析 |
1.2.9 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP在体外培养小鼠巨噬细胞中表达研究 |
2 结果与分析 |
2.1 克隆质粒pUCX-PnirB(CB)、pUCX-PpagC(CC)的构建 |
2.2 新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建 |
2.3 新型基因疫苗报告载体的构建 |
2.4 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
2.5 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中表达研究 |
2.6 重组菌体外培养稳定性 |
2.7 重组菌感染体外培养小鼠巨噬细胞的荧光观察 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第四章 内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物的设计与合成 |
1.2.3 内江猪IL-15基因的克隆和序列分析 |
1.2.4 内江猪IL-15基因的原核表达研究 |
1.2.5 原核表达产物的活性检测 |
1.2.6 内江猪IL-15基因的免疫佐剂作用研究 |
2 结果与分析 |
2.1 内江猪IL-15基因的RT-PCR扩增及TA克隆 |
2.2 内江猪IL-15基因序列分析 |
2.3 原核表达载体DMAL-pmIL15的构建 |
2.4 原核表达条件优化及其产物Western blot分析 |
2.5 融合表达产物的生物活性检测 |
2.6 pIL-15基因的免疫增强作用 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第五章 猪瘟病毒E2基因的分子克隆与原核表达研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物设计与合成 |
1.2.3 CSFV-E2基因的分子克隆与序列分析 |
1.2.4 CSFV-E2蛋白主要抗原区编码基因的TA克隆质粒构建 |
1.2.5 原核重组表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
1.2.6 pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)在大肠杆菌中的表达 |
2 结果与分析 |
2.1 CSFV-E2基因的分子克隆 |
2.2 CSFV-E2基因的序列分析 |
2.3 克隆质粒pUCX-mE2(pe)、pUCX-E2(pe)的构建 |
2.4 原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
2.5 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的SDS-PAGE分析 |
2.6 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的Western Blot分析 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第六章 猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 技术路线 |
1.2.2 引物设计与合成 |
1.2.3 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
1.2.4 融合双基因重组表达载体的构建 |
1.2.5 pEGFP-dME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
1.2.6 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
1.2.7 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
2 结果与分析 |
2.1 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
2.2 融合双基因重组表达载体的构建 |
2.3 pEGFP-ME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
2.4 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
2.5 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细的瞬时表达 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第七章 融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及免疫安全性研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 引物设计与合成 |
1.2.2 重组菌生长特性、生化特性、药敏特性及血清学特性鉴定 |
1.2.3 重组菌体外增殖中重组质粒的稳定性 |
1.2.4 携质粒SC500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖 |
1.2.5 携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠 |
2 结果与分析 |
2.1 重组工程菌体外培养特性检测 |
2.2 S.C500体外培养中质粒的稳定性 |
2.3 携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭和增殖能力的影响 |
2.4 携质粒S.C500免疫BALB/c小鼠 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第八章 融合双基因表达载体重组S.C500活菌疫苗口服接种家兔的体内免疫应答初步研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
1.2.2 双基因融合表达载体重组工程菌的活化培养 |
1.2.3 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
1.2.4 口服免疫重组工程菌菌液的制备 |
1.2.5 试验家兔的口服免疫接种 |
1.2.6 免疫家兔血清抗体水平检测 |
1.2.7 免疫家兔T淋巴细胞增殖检测 |
1.2.8 免疫后家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒试验 |
1.2.9 免疫后家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
2 结果与分析 |
2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
2.2 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
2.3 免疫家兔抗CSFV特异性抗体的检测 |
2.4 免疫家兔抗S.C500特异性抗体的检测 |
2.5 免疫家兔T淋巴细胞增殖能力检测 |
2.6 免疫家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒研究 |
2.7 免疫家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第三部分 全文总结论 |
第四部分 本研究的创新点 |
第五部分 本研究的不足之处 |
第六部分 本研究的展望与建议 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
(6)支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
Abstract |
缩略词(Abbreviation) |
第1章 文献综述 |
1.1 波氏菌病研究进展 |
1.2 沙门氏菌疫苗及载体研究进展 |
1.3 总结与展望 |
第2章 支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与流行病学研究 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 细菌菌种 |
2.1.2 病料来源 |
2.1.3 载体与质粒 |
2.1.4 主要试剂、培养基与试剂盒 |
2.1.5 主要培养基的配制 |
2.1.6 主要溶液的配制 |
2.1.7 主要实验器材 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 病原菌的分离 |
2.2.2 革兰氏染色镜检 |
2.2.3 PCR检测 |
2.2.3 PCR序列测定 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 Bb的分离鉴定及分析结果 |
2.3.3 Bb共感染菌的分离鉴定及分析结果 |
2.3.4 Bb共感染菌T~+Pm的分离鉴定及分析结果 |
2.4 讨论 |
2.4.1 Bb的分离与鉴定方法 |
2.4.2 Bb与其它细菌的混合感染 |
2.4.3 Bb在AR形成中的作用分析 |
第3章 支气管败血波氏杆菌的生物学特性及强毒株的筛选 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 细菌菌种 |
3.1.2 实验动物 |
3.1.3 主要试剂和培养基 |
3.1.4 主要培养基的配制 |
3.1.5 主要实验器材 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 Bb的生长培养特性 |
3.2.2 Bb的小鼠毒力试验和强毒株筛选 |
3.2.3 Bb小鼠气雾攻毒感染模型的建立 |
3.2.4 Bb对猪的感染特性 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 Bb的生长培养特性 |
3.3.2 Bb强毒株的筛选 |
3.3.3 Bb小鼠气雾攻毒模型的建立 |
3.3.4 Bb对猪的感染特性 |
3.4 讨论 |
第4章 支气管败血波氏杆菌的保护性抗原研究 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 细菌菌种、质粒和血清 |
4.1.2 实验动物 |
4.1.3 主要培养基和试剂 |
4.1.4 主要溶液的配制 |
4.2 实验技术 |
4.2.1 PCR扩增 |
4.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化 |
4.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
4.2.4 连接产物的转化 |
4.2.5 大肠杆菌原核诱导表达 |
4.2.6 包涵体提取、纯化与复性 |
4.2.7 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 |
4.2.8 表达产物的Western blot检测 |
4.2.9 ELISA操作 |
4.3 实验方案 |
4.3.1 fhaB和prn基因片段的克隆 |
4.3.2 重组表达质粒的构建及序列测定 |
4.3.3 基因片段的表达及表达产物的纯化 |
4.3.4 各表达产物的小鼠免疫保护力试验 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 FHA和PRN蛋白的序列分析 |
4.3.2 fhaB和prn基因片段的克隆和表达载体的构建 |
4.3.3 fhaB和prn基因片段的表达和纯化 |
4.3.4 小鼠的抗体水平检测结果 |
4.3.5 小鼠的免疫效力试验 |
4.4 讨论 |
第5章 支气管败血波氏杆菌抗体检测间接ELISA方法的建立与应用 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 试验用血清 |
5.1.2 主要药品与试剂盒 |
5.1.3 主要溶液的配制 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 GST-PRN的表达及GST载体蛋白的去除 |
5.2.2 ELISA的操作步骤 |
5.2.3 间接ELISA最佳反应条件的选择 |
5.2.4 确定结果判定标准 |
5.2.5 分析特异性试验 |
5.2.6 敏感性试验 |
5.2.7 重复性试验和方法比较试验 |
5.2.8 ELISA诊断方法的临床应用 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 ELISA检测方法的初步建立 |
5.3.2 ELISA检测方法的初步建立 |
5.3.3 重复性试验 |
5.3.4 分析特异性试验 |
5.3.5 敏感性试验 |
5.3.6 符合率试验 |
5.3.7 ELISA方法的临床初步应用 |
5.4 讨论 |
第6章 表达Bb保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建及生物学特性研究 |
6.1 实验材料 |
6.1.1 菌种和质粒 |
6.1.2 实验动物 |
6.1.3 主要试剂、药品与试剂盒 |
6.1.4 主要培养基的配制 |
6.1.5 主要实验器材 |
6.2 实验技术 |
6.2.1 PCR或酶切产物的回收与纯化 |
6.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
6.2.3 连接产物的转化 |
6.2.4 质粒的小量制备 |
6.2.5 沙门氏菌电转化感受态细胞的制备 |
6.2.6 沙门氏菌的电转化 |
6.3 试验方案 |
6.3.1 HIS-F1P2在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备 |
6.3.2 重组表达质粒pYA-F1P2的构建 |
6.3.3 重组疫苗菌株C501(pYA-F1P2)的构建与鉴定 |
6.3.4 重组菌株C501(pYA-F1P2)的表型鉴定 |
6.3.5 重组菌株C501(pYA-F1P2)的遗传稳定性 |
6.3.6 重组菌株C500(pYA-F1P2)的分泌表达 |
6.3.7 重组菌株C501(pYA-F1P2)对小鼠的毒力试验 |
6.3.8 重组菌株C501(pYA-F1P2)对猪的安全性评价 |
6.4 结果与分析 |
6.4.1 重组表达质粒pYA-F1P2的构建 |
6.4.2 重组菌株C501(pYA-F1P2)的构建与鉴定 |
6.4.3 重组菌株C501(pYA-F1P2)的表型鉴定 |
6.4.4 重组菌株C501(pYA-F1P2)的生长特性 |
6.4.5 重组菌株C501C500(pYA-F1P2)的遗传稳定性 |
6.4.6 重组菌株C501(pYA-F1P2)的分泌表达 |
6.4.7 C501(pYA-F1P2)重组菌株疫苗的毒力测定 |
6.4.8 重组菌株对猪的安全性评价 |
6.5 讨论 |
第7章 支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌疫苗研究 |
7.1 实验材料 |
7.1.1 菌种和质粒 |
7.1.2 实验动物 |
7.1.3 主要试剂、药品与试剂盒 |
7.1.4 主要培养基的配制 |
7.1.5 主要实验器材 |
7.2 实验技术 |
7.2.1 相关试剂 |
7.2.2 ELISA操作 |
7.3 试验方案 |
7.3.1 疫苗制备 |
7.3.2 小鼠的免疫 |
7.3.3 小鼠抗体的ELISA检测方法 |
7.3.4 免疫小鼠的沙门氏菌攻毒 |
7.3.5 免疫小鼠的Bb攻毒 |
7.3.6 仔猪的免疫程序 |
7.3.7 免疫仔猪的沙门氏菌攻毒 |
7.3.8 免疫仔猪的Bb攻毒 |
7.4 结果与分析 |
7.4.1 免疫小鼠的沙门氏菌抗体检测 |
7.4.2 免疫小鼠针对沙门氏菌感染的保护力 |
7.4.3 免疫小鼠的rF1P2血清抗体检测 |
7.4.4 免疫小鼠针对Bb感染的保护力 |
7.4.5 免疫小鼠的rF1P2肺脏抗体检测 |
7.4.6 免疫仔猪的沙门氏菌抗体检测 |
7.4.7 免疫仔猪针对沙门氏菌感染的保护力 |
7.4.8 免疫仔猪的rF1P2血清抗体检测 |
7.4.9 免疫仔猪针对Bb感染的保护力 |
7.5 讨论 |
第8章 结论 |
参考文献 |
附件 |
致谢 |
(7)猪水肿病基因工程亚单位菌苗及F18~+E. coli的病原学研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词 |
第1章 文献综述 |
1.1 猪水肿病的病原学 |
1.1.1 猪水肿病的发现 |
1.1.2 产类志贺毒素大肠杆菌的特征 |
1.2 猪水肿病大肠杆菌的毒力因子 |
1.2.1 F18ab菌毛 |
1.2.2 类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe) |
1.3 猪水肿病的诊断 |
1.3.1 猪水肿病的流行病学 |
1.3.2 临床症状及剖检病变 |
1.3.3 实验室诊断方法 |
1.4 猪水肿病的免疫研究 |
1.4.1 药物预防 |
1.4.2 菌体灭活苗 |
1.4.3 亚单位苗 |
第2章 F18~+ E.coli的分离鉴定 |
前言 |
技术路线 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.1.1 菌株和质粒 |
1.1.2 工具酶及主要试剂 |
1.1.3 培养基 |
1.1.4 引物的设计及合成 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 病原分离 |
1.2.2 生化鉴定 |
1.2.3 血清型鉴定 |
1.2.4 耐药性检测 |
1.2.5 菌毛F18的PCR检测 |
1.2.6 Ee株的主要毒力因子的克隆与序列分析 |
2 结果与分析 |
2.1 细菌分离与鉴定 |
2.1.1 细菌分离与生化鉴定 |
2.1.2 F18~+ E.coli的检出与血清定型 |
2.2 耐药性检测 |
2.3 Ee株的主要毒力因子的克隆与序列分析 |
4 小结及讨论 |
4.1 F18~+E. coli血清型定型 |
4.2 药敏试验 |
4.3 序列分析 |
第3章 F18~+ E.coli的血清流行病学调查 |
前言 |
技术路线 |
1 实验材料 |
1.1 菌种与质粒 |
1.2 血清 |
1.3 主要药品及试剂 |
1.4 主要培养基 |
1.5 酶及试剂盒 |
1.6 质粒抽提与鉴定试剂 |
1.7 SDS-PAGE试剂 |
1.8 ELISA缓冲液 |
1.9 试验动物 |
2 试验方法 |
2.1 FedF蛋白的表达与纯化 |
2.2 ELISA试验条件的确定 |
2.2.1 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定) |
2.2.2 ELISA的操作步骤 |
2.2.3 ELISA阴阳界限的确定 |
2.2.4 ELISA方法的重复性试验 |
2.3 ELISA的临床应用 |
2.3.1 FedF-ELISA的血清学调查 |
2.3.2 FedF-ELISA与细菌分离鉴定的比较 |
2.4 统计学方法 |
3 结果与分析 |
3.1 FedF-ELISA检测方法的建立 |
3.1.1 FedF表达条件的优化 |
3.1.2 抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择 |
3.1.3 ELISA结果判定标准的确定 |
3.1.4 FedF-ELISA特异性和敏感性 |
3.2 FedF-ELISA的临床应用 |
4 讨论与结论 |
4.1 讨论 |
4.1.1 FedF-ELISA检测方法的建立 |
4.1.2 血清流行病学调查 |
4.2 结论 |
第4章 水肿毒素B亚单位与F18菌毛黏附素FedF的融合表达及免疫原性研究 |
前言 |
技术路线 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株、血清及细胞 |
1.2 酶及主要试剂 |
1.3 Western-blot试剂 |
1.4 融合基因的克隆 |
1.4.1 引物设计 |
1.4.2 PCR扩增 |
1.5 重组表达质粒的构建及序列测定 |
1.6 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE电泳 |
1.7 Western-blotting |
1.8 融合蛋白抗血清的制备 |
1.9 抗血清的体外活性试验 |
1.9.1 抗血清对SLT-Ⅱe的细胞毒性中和试验 |
1.9.2 黏附试验及抗血清黏附抑制试验 |
1.10 表达蛋白对小鼠的免疫原性 |
2 结果 |
2.1 重组质粒pKSF的构建及序列测定 |
2.2 融合基因编码蛋白的生物信息学分析 |
2.3 GST-SF的表达及检测 |
2.4 表达产物抗血清体外活性试验 |
2.4.1 表达产物抗血清的体外细胞毒性抑制试验 |
2.4.2 菌毛黏附及黏附抑制实验 |
2.5 融合蛋白对小鼠的免疫原性试验 |
2.5.1 小鼠抗体消长情况 |
2.5.2 免疫保护性试验结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
第5章 猪水肿病新型基因工程类毒素菌苗对小鼠及猪免疫效力的研究 |
前言 |
技术路线 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.1.1 菌株 |
1.1.2 主要试剂 |
1.1.3 试验动物 |
1.2 方法 |
1.2.1 GST-SF在BL-21中的诱导表达及纯化 |
1.2.2 细菌的平板菌落计数 |
1.2.3 油乳剂亚单位菌苗的制备 |
1.2.4 病理切片的制作 |
1.2.5 抗体的检测 |
1.2.6 攻毒剂量的确定 |
1.2.7 亚单位菌苗的安全性试验 |
1.2.8 亚单位菌苗对小鼠及仔猪效力的观测 |
1.2.9 攻毒后血清中生化指标的检测 |
1.2.10 攻毒后日增重测定 |
1.2.11 攻毒后剖检病理学及组织病理学观察 |
1.2.12 肾小管的组织病理学积分 |
2 结果与分析 |
2.1 GST-SF蛋白的提取与纯化 |
2.2 亚单位菌苗对怀孕母猪的安全性试验 |
2.3 小鼠及仔猪抗体水平的检测 |
2.3.1 小鼠抗体水平的检测 |
2.3.2 仔猪抗体水平的检测 |
2.4 仔猪攻毒后的体温变化及临床表现情况 |
2.5 攻毒后的保护效力 |
2.5.1 对小鼠的保护力 |
2.5.2 对仔猪的保护力 |
2.6 仔猪攻毒后的生化指标 |
2.7 仔猪日增重的测定 |
2.8 攻毒后的典型病理变化 |
2.9 病理组织学变化 |
2.10 肾小管的组织病理学积分 |
4 讨论 |
4.1 猪水肿病灭活苗 |
4.2 猪水肿病亚单位菌苗 |
4.3 血清生理、生化指标 |
4.4 病理学检验 |
5 结论 |
参考文献 |
附录 |
(8)仔猪水肿病的防治(论文提纲范文)
1 流行特点及病因 |
2 临床症状 |
3 病理变化 |
4 诊断 |
5 防治措施 |
5.1 减轻仔猪断奶后营养应激的影响 |
5.2 降低仔猪饲料中的蛋白质含量 |
5.3 应用酸化剂 |
5.4 补铁 |
5.5 补硒 |
5.6 药物预防 |
5.7 疫苗预防 |
5.8 断奶前后驱虫 |
5.9 消灭传染源 |
5.1 0. 1 控制全身症状 |
5.1 0. 2 巩固预防 |
6 讨论 |
(9)猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
Abstract |
缩略词表(Abbreviation) |
第1章 文献综述 |
1.1 减毒沙门氏菌疫苗的研究进展 |
1.1.1 经典的沙门氏菌疫苗 |
1.1.2 新型沙门氏菌减毒疫苗 |
1.1.3 想的减毒疫苗 |
1.2 减毒沙门氏菌载体的研究进展 |
1.2.1 减毒沙门氏菌载体的优点 |
1.2.2 减毒沙门氏菌载体的缺点与解决方法 |
1.2.3 选择标记的使用 |
1.2.4 DNA疫苗载体 |
1.2.5 减毒沙门氏菌载体在国内的应用 |
1.3 猪霍乱沙门氏菌的危害与防制 |
1.3.1 病原学 |
1.3.2 流行病学 |
1.3.3 发病机制 |
1.3.4 临床症状 |
1.3.5 病理变化 |
1.3.6 诊断 |
1.3.7 预防措施 |
1.3.8 治疗 |
1.4 猪霍乱沙门氏菌疫苗及载体的研究进展 |
1.4.1 国外研究进展 |
1.4.2 国内研究进展 |
第2章 研究目的与意义 |
第3章 材料与方法 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 质粒、菌株和培养条件 |
3.1.2 工具酶和试剂 |
3.1.3 主要培养基及其配制 |
3.1.4 缓冲液 |
3.1.5 细菌基因组DNA提取试剂 |
3.1.6 实验动物 |
3.1.7 引物 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 沙门氏菌基因组DNA提取 |
3.2.2 PCR或酶切产物的回收与纯化 |
3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
3.2.4 连接产物的转化 |
3.2.5 重组质粒的快速鉴定 |
3.2.6 重组质粒的酶切鉴定 |
3.2.7 质粒的制备 |
3.2.8 沙门氏菌电转化 |
3.2.9 沙门氏菌ELISA检测方法的建立 |
3.2.10 大肠杆菌原核表达 |
3.2.11 沙门氏菌属的PCR鉴定 |
3.2.12 猪霍乱沙门氏菌C500株crp及asd基因的克隆与鉴定 |
3.2.13 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建 |
3.2.14 接合转移与C500crp~-、C500crp~-/gfp~+、C500crp~-/asd、C500crp~-/gfp~+/asd、C500asd缺失株的筛选鉴定 |
3.2.15 C500crp~-缺失株生物学特性鉴定 |
3.2.16 C500crp~-缺失株对小鼠的免疫试验 |
3.2.17 C500crp~-缺失株对小鼠的攻毒保护试验 |
3.2.18 绿荧光蛋白基因gfp在沙门氏菌中的表达 |
3.2.19 致水肿病大肠杆菌水肿毒素B亚基(SLT-Ⅱ vB)在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
第4章 结果与分析 |
4.1 crp、asd基因的克隆与序列分析 |
4.1.1 crp基因的克隆与序列分析 |
4.1.2 asd基因的克隆与序列分析 |
4.2 重组自杀性质粒pREcrp、pREcrpgfp、pREasd的构建 |
4.2.1 重组自杀性质粒pREcrp的构建 |
4.2.2 重组自杀性质粒pREcrpgfp的构建 |
4.2.3 重组自杀性质粒pREasd的构建 |
4.3 C500crp~-、C500crp~-/gfp~+、C500crp~-/asar、C500crp~-/gfp~+/asar、C500asd缺失株的筛选与鉴定 |
4.3.1 C500crp~-缺失株的筛选与鉴定 |
4.3.2 C500crp~-/gfp~+缺失株的筛选与鉴定 |
4.3.3 C500crp~-/asd、C500crp~-/gfp~+/asd、C500asd缺失株的筛选与鉴定 |
4.4 C500crp~-缺失株生物学特性鉴定 |
4.4.1 C500crp~-缺失株表型鉴定 |
4.4.2 C500crp~-缺失株生长特征鉴定 |
4.4.3 C500crp~-缺失株对小鼠的毒力试验 |
4.5 C500crp~-缺失株对小鼠的免疫试验 |
4.6 C500crp~-缺失株对小鼠的保护试验 |
4.7 gfp在C500及C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
4.7.1 gfp的克隆 |
4.7.2 gfp在C500及C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
4.8 SLT-Ⅱ vB在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
4.8.1 SLT-Ⅱ vB的克隆 |
4.8.2 SLT-Ⅱ vB在C500crp~-/asd缺失株中的表达 |
4.8.3 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)对小鼠的免疫试验 |
4.8.4 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)诱导小鼠的DTH反应 |
4.8.5 重组菌C500crp~-/asd (pYASLⅡIB)诱导小鼠的免疫保护反应 |
第5章 讨论与结论 |
5.1 crp缺失对毒力及免疫原性的影响 |
5.2 重组自杀性质粒介导基因整合的筛选鉴定 |
5.3 外源基因在C500crp~-/gfp~+缺失株染色体中的表达效率 |
5.4 gfp基因在C500crp~-/asd缺失株平衡致死系统中的表达 |
5.5 SLT-Ⅱ vB基因在C500crp~-/asd缺失株平衡致死系统中的表达 |
5.6 重组菌C500crp~-/asd (pYASLTⅡB)对小鼠的免疫试验 |
5.7 结论 |
参考文献 |
致谢 |
(10)仔猪水肿病病原分离鉴定及免疫防制研究(论文提纲范文)
第一章 猪水肿病研究进展 |
1 流行特点 |
2 发病机理 |
2.1 致病菌及其毒素 |
2.2 致病机理 |
3 临床症状 |
4 病理变化 |
4.1 临床病理剖检变化 |
4.2 病理组织学变化 |
5 诊断 |
5.1 病原菌分离鉴定 |
5.1.1 病料采集 |
5.1.2 分离培养 |
5.1.3 生化试验 |
5.2 鉴别诊断 |
5.3 Dot-ELISA |
6 综合预防措施 |
6.1 抗病选育 |
6.2 控制传染源 |
6.3 加强仔猪断奶前后的饲养管理 |
6.4 疫苗免疫 |
6.5 应用微生态制剂 |
7 治疗措施 |
7.1 药物治疗 |
7.2 高免血清治疗 |
7.3 中医疗法 |
第二章 仔猪水肿病病原的分离鉴定 |
1 材料 |
1.1 病料 |
1.2 标准菌株及标准抗“O”血清 |
1.3 试验动物 |
1.4 培养基 |
2 方法 |
2.1 病原菌的分离培养及形态染色特性检查 |
2.2 生化试验 |
2.3 分离菌的血清型鉴定 |
2.4 动物致病性试验 |
3 结果 |
3.1 形态染色特性 |
3.2 培养特性 |
3.3 生化特性 |
3.4 血清型鉴定 |
3.5 致病性试验结果 |
4 讨论 |
第三章 仔猪水肿病多价灭活苗的研制及临床应用 |
1 材料和方法 |
1.1 菌株 |
1.2 实验动物 |
1.3 其他材料 |
1.4 大肠杆菌增殖及灭活 |
1.5 灭活疫苗的制造 |
1.6 疫苗的检验 |
1.7 动物免疫 |
1.8 微量凝集试验方法的建立及应用 |
1.8.1 抗原的制备 |
1.8.2 待检血清 |
1.8.3 最佳反应条件的确立 |
1.8.4 反应术式和判定标准 |
2 结果 |
2.1 疫苗的无菌检验与安全试验 |
2.2 微量凝集试验最佳反应条件 |
2.3 免疫猪血清抗体水平检测结果 |
2.4 猪场仔猪水肿病免疫防制前后发病情况 |
3 讨论 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
四、仔猪水肿、副伤寒二联灭活菌苗的效果观察(论文参考文献)
- [1]鸡抗猪产肠毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价卵黄抗体的变化规律及喷干工艺的研究[J]. 程福亮,梁瑾,陈甜甜,宿志瑞,范群平,聂兆晶,谷巍. 动物医学进展, 2013(03)
- [2]仔猪水肿病的综合防治措施[J]. 赵继红. 中兽医学杂志, 2012(04)
- [3]猪高热病的诊断与防治[J]. 刘丽萍,王守君,单艳君,朱永信,张玲,张谦. 养殖技术顾问, 2011(04)
- [4]猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究[D]. 满晓营. 华中农业大学, 2009(S1)
- [5]含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用[D]. 韩国全. 四川农业大学, 2009(07)
- [6]支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究[D]. 赵战勤. 华中农业大学, 2008(01)
- [7]猪水肿病基因工程亚单位菌苗及F18~+E. coli的病原学研究[D]. 刘国平. 华中农业大学, 2007(02)
- [8]仔猪水肿病的防治[J]. 孙秉睿. 农业科技与信息, 2006(08)
- [9]猪霍乱沙门氏菌C500株crpˉ、asdˉ缺失株平衡致死系统的构建及应用[D]. 徐引弟. 华中农业大学, 2006(02)
- [10]仔猪水肿病病原分离鉴定及免疫防制研究[D]. 闫祖书. 西北农林科技大学, 2004(03)