一、1q12-22染色体位点在B细胞性NHL基因组中的不稳定性（论文文献综述）
薛蓓[1]（2021）在《基于PCR的HERV-K（HML-2）靶向富集测序技术的建立及应用》文中指出HERV-K（HML-2）是人内源性逆转录病毒K（Human Endogenous Retrovirus K,HERV-K）中整合入人基因组时间最短的家族成员,具有最少的突变累积及最高的生物学活性。在肿瘤和自身免疫病中可检测到HERV-K（HML-2）的异常表达,并且发现位于其序列两端的长末端重复序列（long terminal repeats,LTR）可能通过参与调控宿主基因组的转录模式诱导疾病的发生。在多种疾病和不同种族群体间检测到的位点频率存在显着性差异的HERV-K（HML-2）位点是深入研究HERV-K（HML-2）潜在致病机制的很好的切入点,也有助于进一步了解人类的进化过程。然而,由于不同HERV-K（HML-2）位点序列的高度相似性,目前仍缺乏有效的实验手段以获取全基因组水平上HERV-K（HML-2）位点的分布信息。因此,在本研究中,我们希望通过建立一种高效的实验方法,实现在全基因组水平上对HERV-K（HML-2）位点的检测,为进一步研究HERV-K（HML-2）的生物学功能奠定基础。本研究中首先建立了一种基于PCR的HERV-K（HML-2）靶向富集测序（PCR-based Target Enrichment Sequencing of HERV-K（HML-2）,PTESHK）技术。PTESHK技术可以通过对HERV-K（HML-2）插入位点附近基因组序列的靶向扩增,结合高通量测序技术,以较低的测序深度及数据分析的时间成本,高效率的实现对人基因组中所有HERV-K（HML-2）位点的检测。PTESHK技术不仅可以对已知的位点进行检测,还可以发现新的HERV-K（HML-2）位点,从而在全基因组水平上确定HERV-K（HML-2）位点的分布。利用PTESHK技术在3个个体（每个个体各3次实验重复）中,共检测到978个HERV-K（HML-2）位点,其中包括35个新的位点。PTESHK技术可以用于不同个体间多态性插入HERV-K（HML-2）位点的检测。在本研究中的3个个体间共检测到14个具有插入多态性的HERV-K（HML-2）位点,其中位点solo-LTR330和N6p21.32是首次被检测为多态性插入位点。之后,利用PTESHK技术对4个前列腺癌细胞系（DU145、LNCa P、PC-3和VCa P）基因组中HERV-K（HML-2）位点的分布进行检测。每个细胞系同样进行3次实验重复。通过对各个细胞系多次实验重复中HERV-K（HML-2）位点检测能力的评估,及不同细胞系间多态性插入HERV-K（HML-2）位点的检测,进一步验证了PTESHK技术的实验重复性及其对于多态性插入位点的检测能力。在4个细胞系间共检测到26个多态性插入的HERV-K（HML-2）位点。比较不同细胞系间的多态性插入位点,发现PC-3与其他细胞系相比缺失位于Y染色体的6个HERV-K（HML-2）位点,这与PC-3细胞系中Y染色体存在的异常现象一致,推测通过对HERV-K（HML-2）位点在基因组上分布的检测,可能侧面体现染色体的异常现象。HERV-K（HML-2）可能可以作为前列腺癌诊断或分型的潜在的分子标志物。PTESHK对于具有实验重复的不同个体间多态性插入HERV-K（HML-2）位点具有很好的检测能力。为了进一步优化PTESHK的分析步骤,使其适用于无实验重复样本间多态性插入HERV-K（HML-2）位点的检测,对上述具有实验重复的3个个体和4个细胞系的数据进行整合分析,筛选出638个利用PTESHK技术检测到的具有较好实验重复性或相对较高CPM值的HERV-K（HML-2）位点。并通过对4个无实验重复个体的HERV-K（HML-2）位点的检测,验证以这638个位点为参考进行多态性位点检测的可行性。在这4个个体间共检测到19个多态性插入位点,通过设计特异性引物对其中14个位点的插入多态性完成验证。另外5个位点无法验证可能是由于其位于重复元件中难以特异性扩增的缘故。因此,PTESHK技术可以应用于无实验重复的不同个体间的多态性插入HERV-K（HML-2）位点的检测。为了研究HERV-K（HML-2）是否仍具有转座活性,及其在人类发育过程中可能发挥的作用,利用PTESHK技术对4对同卵双胎样本间差异位点进行检测以判断是否存在从头插入位点,包括2对新生儿同卵双胎和2对老龄同卵双胎。在1对新生儿同卵双胎间检测到1个差异位点,但未能通过特异性PCR完成验证。在其他3对同卵双胎中均未发现差异位点。虽然本研究中无法证实HERV-K（HML-2）从头插入位点的存在,但仍为进一步研究HERV-K（HML-2）可能存在的转座活性提供论据。利用PTESHK技术对47个来自中国和意大利群体的个体间的多态性插入HERV-K（HML-2）位点进行检测,共检测到36个多态性插入位点。并且通过比较同一HERV-K（HML-2）位点在不同种族群体间的频率,发现8个存在显着性差异的HERV-K（HML-2）位点,可能与中国人群与意大利人群之间的种族差异有关。通过比较欧洲人群、亚洲人群与非洲人群中多态性插入HERV-K（HML-2）位点的频率发现,所有在欧洲人群或亚洲人群中可以检测到的多态性插入位点均可以在非洲人群中检测到,说明这些位点均是在人类迁徙出非洲大陆前整合入人基因组的。此外,部分多态性插入位点在欧洲人群和亚洲人群中与非洲人群相比表现出明显的趋于固定存在（频率为100%）或趋于消失（频率为0）的趋势,体现了在欧洲人群中和亚洲人群中出现的遗传多样性的减少。因此,对于不同种族群体间多态性插入HERV-K（HML-2）位点频率的检测为研究人类迁徙和进化过程提供了一种新的基因组研究方法。总而言之,本研究中通过构建一种基于PCR的HERV-K（HML-2）靶向富集测序技术实现对全基因组水平上HERV-K（HML-2）位点分布的检测。同时,该技术可以用于不同疾病群体或不同种族群体间多态性插入HERV-K（HML-2）位点的分析。本方法将作为进一步理解HERV-K（HML-2）生理病理功能,以及研究其在人类进化过程中可能发挥的作用的补充手段。
刘梦[2]（2021）在《伴有额外染色体异常的Ph+慢性粒细胞性白血病患者基因组改变的研究》文中研究表明目的:慢性粒细胞性白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）以9号和22号染色体之间平衡易位所形成的费城（Philadelphia,Ph）染色体为特征性改变。除Ph染色体外,非随机的、多样的染色体畸变的出现被认为是CML发生了克隆演变（Clonal Evolution,CE）,在慢性期（Chronic Phase,CP）患者中少见,往往与疾病进展和不良预后有关。本研究通过整合应用染色体核型分析、荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）、微阵列比较基因组杂交（Array comparative genomic hybridization,aCGH）和全外显子组测序（Whole exome sequencing,WES）检测技术,旨在发现CML发生Ph染色体以外的克隆性染色体改变时基因组变化特点,揭示与CML相关的潜在基因,探讨其在CML疾病发生发展中的意义,从而增加对CML遗传学异常的认知,为CML患者的诊断和治疗提供新的思路。方法:收集2000年至2019年,在美国俄克拉荷马大学健康医学中心遗传学实验室诊断为CML的患者骨髓或外周血标本。应用染色体核型分析和FISH检测患者的细胞遗传学异常。对只具有Ph染色体改变的患者应用aCGH技术分析其基因组拷贝数变异（Copy Number Variations,CNVs）情况。在慢性期CML患者中随机选取10例伴有额外染色体异常（Additional Chromosomal Abnormalities,ACAs）的患者和10例经aCGH检测后仍只具有Ph染色体改变的患者,分别纳入实验组和对照组进行全外显子组测序,应用生物信息学分析对基因变异进行过滤和注释,对比两组变异发生的频率,筛选出与慢性粒细胞性白血病患者发生额外染色体异常相关的基因体细胞变异。结果:本研究我们共收集了106例CML患者的样本,进行常规细胞遗传学检测后在84例患者中只发现了Ph染色体的产生和BCR-ABL1融合基因的形成,在其余的22例患者中发现了除Ph染色体外的其他染色体克隆性改变。84例患者中有49例成功提取了DNA进行aCGH检测,最终在11例（22.4%）患者中发现了17个致病性的基因组拷贝数变异。9号染色体长臂部分丢失del（9q）是其中最常出现的CNVs,发生在5例（45.5%）患者中,累及的染色体区段为9q34.11-q34.12。3例（60%）患者的del（9q）片段中涵盖了ASS1基因,其中2例患者同时观察到BCR-ABL1融合基因信号的缺失。20例慢性期CML患者经全外显子组测序后共获得了122.05Gb的原始数据,样本平均测序深度42.41×（16.69×～72.37×）,平均序列覆盖度为96.40%。实验组的基因组总体变异个数、单核苷酸变异（Single-Nucleotide Variants,SNV）个数,插入和缺失变异（Insersion and Deletion,INDEL）个数均比对照组多,但两组变异个数之间的差异并未发现具有统计学意义（P>0.05）。两组共发现159个可引起氨基酸改变并导致所编码蛋白质功能变化的编码区体细胞变异,实验组体细胞变异数目高于对照组（实验组88个,对照组71个,P>0.05）,其中常见于CML的肿瘤相关体细胞变异19个,包括10个错义单核苷酸变异,3个非移码缺失变异,2个移码缺失变异和4个终止子获得变异。非移码变异rs57875368（COSM1476940,NM＿007350:exon1:c.582＿584del:p.194＿195del）是实验组中高频出现的变异（实验组6/10例,对照组1/10例,P=0.043）,该变异位点定位于基因PHLDA1编码区。在实验组中我们还发现了两个尚未在单核苷酸多态性数据库和肿瘤体细胞变异数据库中报道的新的体细胞变异位点,分别定位于基因TLE1（p.E748V）和基因CSMD2（p.W229X）的编码区。结论:本研究我们发现Ph+慢性粒细胞性白血病患者的基因组不平衡改变复杂多样,拷贝数变异以染色体9q的部分丢失最为常见,常与不良预后有关,del（9q）所涵盖的ASS1基因缺失可作为潜在的抑癌因素在CML疾病的治疗和预后中起到重要作用。我们在伴有额外染色体异常的患者中筛选出了一个特异的高频体细胞变异,并只在该类患者中发现了2个尚未被肿瘤体细胞变异数据库和单核苷酸多态性数据库收录的新的体细胞变异位点,这三个分别定位于基因PHLDA1、TLE1和CSMD2的体细胞变异可能有助于CML发生额外染色体异常,在疾病的克隆演变中起到重要作用。我们所发现的遗传信息为伴有额外染色体畸变的CML患者的新的靶向药物研究提供了分子基础。
阎禹廷[3]（2021）在《第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变》文中研究说明[目的]套细胞淋巴瘤（MCL）是侵袭性非霍奇金淋巴瘤（NHL）的一种罕见亚型,决定其临床预后的遗传学因素尚不明确。目前尚没有MCL的基因组学和转录组学的整合研究,缺乏对疾病的整体认识。且MCL在临床及遗传学存在高度异质性,患者对治疗的反应及预后也相差很大,基于遗传学特点对其区分亚型有助于临床危险度分层并指导精准治疗。[方法]该研究对134例MCL患者的152个DNA样本进行了全外显子测序（WES）,其中包括123例初治和11例复发的患者,以及16例有初诊和复发续贯样本的患者。其中95例患者接受了标准的基于大剂量阿糖胞苷的免疫化疗,48个样本具有匹配的RNA测序数据。研究者们使用GATK,MutSig2CV和GISTIC2.0识别体细胞突变和拷贝数变化,应用MutationalPatterns定义突变特征,并利用ABSOLUTE和PhylogicNDT确定患者的克隆进化的模式;并应用NNMF非负矩阵分解聚类法定义MCL的不同分子亚组,进一步探索不同亚组患者的基因表达谱和临床预后。[结果]每个样本体细胞突变的中位数为29（范围8-72）。该研究共鉴定出34个重现性突变基因,其中包含报道过的驱动突变（TP53,ATM,CCND1,KMT2D,NSD2,SMARCA4,ARID1A,NOTCH1,NOTCH2,BIRC3,TRAF2,UBR5）和新发现的突变（SP140,SVEP1,LRP1B,LRP2,PCDH10）。并检测到7个区域的染色体拷贝数增加和13个区域染色体缺失（频率>10%,q<0.1）。基于无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的多因素COX模型分析显示,IGHV突变状态,MIPI风险分层,TP53突变/del（17p13）,SP140 突变/del（2q36）以及 NOTCH1、SMARCA4、PCDH10 突变和 del（9p）,均具有显着的独立预后意义。研究进一步探究了 MCL遗传事件的克隆状态和克隆演变模式。Del（11q22）和de1（9p）倾向于表现为主克隆,可能是疾病发生的早期事件,而NSD2、LRP1B和CTNNA2中的突变更可能是亚克隆（q<0.05）。通过对复发前后遗传学异常的动态变化将MCL患者分为三类:69%（11/16）的患者具有显着的克隆演变（CCF变化>0.5）;25%患者具有轻度的克隆演变（0.2≤CCF变化≤0.5）;6%患者无克隆演变（CCF变化<0.2）。具有显着克隆演变的患者与轻度或无克隆演变患者相比,生存时间明显减少（总生存时间为47.5个月vs.未达到,P=0.041;复发后生存时间为17.1个月vs.未达到,P=0.023）。通过对上述重现性体细胞突变和拷贝数变化进行整合分析,将MCL分为四个分子亚型（Cluster,C）,每个亚型具有不同的基因表达谱和临床特征。C1和C2-4分别与MCL的惰性和侵袭性临床特征相关;且两种类型MCL的细胞起源不同,C1和C2-4分别具有丰富的记忆B细胞和CCR6阴性生发中心明区B细胞的基因表达特征。其中C1亚型临床上大多表现为白血病样非结性惰性MCL,具有IGHV突变、SOX11阴性、CCND1突变、amp（11q13）的特征,转录组数据显示此群患者BCR信号通路明显激活。C2亚型以del（11q22）、del（1p21）、ATM突变为主要特征,并且伴有NF-κ B和DNA修复信号通路的上调。C3亚型多表现为SP140、NOTCH1和NSD2突变,并伴有明显的NF-κB和BCR信号通路下调。C4亚型的母细胞型或多形性MCL发生率最高（23.7%,P=0.016）,常伴有 del（17p）、del（13q）、del（9p）以及 TP53 和 TRAF2突变;该亚型还表现为的MYC信号通路的激活及增殖相关基因的过表达。重要的是,这四个分子亚型的患者表现出明显的预后差异,中位PFS在C1亚型中尚未达到,C2亚型为41.2个月,C3亚型为30.7个月,C4亚型为16.1个月（P<0.001）。[结论]该研究首次对MCL的基因组学和转录组学进行整合分析,揭示了 MCL遗传特征图谱,并对MCL患者根据遗传学特征进行分子分型,不同亚型患者表现出特征性基因表达谱和临床预后。该研究揭示了与临床预后相关的遗传学特征,并将指导后续MCL治疗策略的开发。[目的]慢性淋巴细胞白血病（CLL）在欧美白种人中发病率较高,占成人白血病的20-30%,但在中国发病率仅为3-5%,且中国CLL患者还具有起病年龄较早,疾病侵袭性偏高,IGHV突变率较高及使用BCR典型模式偏好性不同等特征。我们推测可能是特征性遗传学改变导致的疾病表型差异。[方法]为了定义中国CLL患者的突变谱,我们通过深度靶向测序（Illumina MiSeq平台）检测了 126例CLL患者（包含中1 17例初诊CLL和9例复发CLL）中的91个CLL驱动基因的突变情况。随后我们把212例CLL患者样本（188例初诊患者和24例复发患者）组成一个验证队列,进一步验证了9个重现性基因突变。通过荧光原位杂交（FISH）和Sanger测序分别分析所有患者的细胞遗传学异常和IGHV突变状态。免疫荧光比较有无KMT2D突变的细胞的H3K4me3荧光强度,药敏试验检验KMT2D突变对伊布替尼和地西他滨的敏感性的影响,并探究两者是否有协同作用。[结果]除了 TP53（17.5%）,SF3B1（14.3%）,ATM（13.7%）,NOTCH1（8.7%）,FBXW7（8.7%）这些已知驱动基因突变以外,中国CLL患者的KMT2D（12.7%）和MYD88（10.3%）突变频率明显高于西方国家（P<0.01）。38个MYD88突变均在未接受过治疗的CLL患者中检测出,其中17个突变（45%）位于L265P热点位置,第二常见的热点区域为V217F（29%）,其次为S219C（13%）。我们发现,有MYD88突变的患者中,男性明显占优势（P=0.002）,且多为IGHV突变型（P<0.001）。此外,我们还发现,多数伴有单克隆丙种球蛋白病（3 IgG,2 IgM,P=0.008）,或伴有乙肝病毒感染（P=0.029）的CLL患者更容易发生MYD88突变。MYD88突变的患者显示出比野生型患者明显更久的首次治疗时间（TTT 5.5 vs.2.9 年,P=0.027）。70%的KMT2D突变是无义,剪接位点或移码插入突变,这些功能丧失性突变会产生C端截短的蛋白质。与IGHV突变状态的整合分析发现,具有KMT2D突变的CLL患者偏好性使用VH4-34和VH4-39（P=0.001,P=0.034）,并且富含子集#8（4/12[33.3%],P=0.012）,这是中国CLL相较于西方CLL的特性性BCR典型子集。与KMT2D野生型相比,KMT2D突变的CLL的预后较差（TTT分别为2.3年和3.7年,对P=0.079）。多变量Cox回归模型纳入IGHV状态,Del（17p）/TP53突变,Rai/Binet期,β 2-微球蛋白后,KMT2D突变仍为早期治疗的独立危险因素（P=0.025）。KMT2D是一种组蛋白赖氨酸特异性甲基转移酶,因此我们通过药敏试验探究9例伴有KMT2D截短突变和6例无KMT2D突变的患者的原代CLL细胞对BTK抑制剂伊布替尼±染色质修饰抑制剂地西他滨或西达本胺的敏感性。KMT2D突变的CLL细胞对伊布替尼的敏感性降低,对地西他滨的敏感性更高,而对西达本胺的敏感性与野生型CLL细胞相似。同时,我们发现伊布替尼和地西他滨有明显的协同细胞毒性,免疫荧光实验证实,KMT2D突变的CLL细胞对染色质修饰抑制剂的敏感可能是由于细胞内H3K4me3的减少所致。[结论]我们观察到中国CLL相较于西方CLL,患者的MYD88和KMT2D突变发生率较高。KMT2D突变的CLL在体外细胞实验中,表现出H3K4甲基化活性降低,且对地西他滨更敏感。伊布替尼联用地西他滨对KMT2D突变的CLL细胞有协同治疗作用。本研究结果首次尝试从分子遗传学角度解释中西方CLL临床特征和表型差异,提出中西方人群之间CLL的发病机制可能存在差异,并为个体化治疗提供理论基础。
陈娟[4]（2021）在《卵巢恶性生殖细胞肿瘤遗传变异基因的筛选》文中进行了进一步梳理卵巢恶性生殖细胞肿瘤（malignant ovarian germ cell tumors,MOG-CTs）是一种少见的妇科恶性肿瘤,约占卵巢恶性肿瘤的3%。好发于儿童及青年女性,对患者的生育功能及生活质量产生严重影响。早期卵巢恶性生殖细胞肿瘤治愈率较高,晚期患者治愈率亦可达到75%,但疾病复发后治疗效果不佳,死亡率较高。目前,卵巢恶性生殖细胞肿瘤的发病机制尚未完全阐明。近年来,研究者们对生殖细胞恶性肿瘤的基因突变情况研究表明,胚系突变可能是疾病发生的早期分子事件。因此,进一步探讨卵巢恶性生殖细胞肿瘤中胚系基因突变情况,有助于了解卵巢恶性生殖细胞肿瘤形成的原因及明确其发病机制,为卵巢恶性生殖细胞肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。本研究采用Illumina Nova Seq 6000平台对卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者外周血进行全外显子测序,应用实时荧光定量PCR检测全外显子测序筛出的拷贝数变异基因OCT4,并分析其蛋白表达情况及与临床病理特征的关系。为这种发生于卵巢上的少见的病理类型的恶性肿瘤基因组学特征提供了新的视角,进而为今后卵巢恶性生殖细胞肿瘤的进一步研究以及诊疗提供理论依据。第一部分卵巢恶性生殖细胞肿瘤全外显子胚系突变检测及生物信息学分析目的:采用第二代测序技术分析卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者外周血DNA中潜在的胚系突变,发现与卵巢恶性生殖细胞肿瘤发生相关的遗传易感基因并初步探讨可能的遗传机制。方法:采用Illumina Nova Seq 6000平台对60例卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者外周血DNA进行全外显子测序,筛选胚系突变基因并进行生物信息学分析,对突变基因进行GO/KEGG信号通路分析。结果:卵巢恶性生殖细胞肿瘤存在243个胚系突变位点及拷贝数变异。对拷贝数变异区域所在的基因进行功能分析,富集的GO条目主要集中于基因表达正负调控、细胞分化的负调控、免疫反应的T细胞活化、G蛋白偶联受体的信号通路、细胞增殖正调控、凋亡过程的负调控、转录负调控、T细胞聚集等生物过程,富集的pathway在生物过程方面主要集中于调节干细胞多能性的信号通路、RIG-I-like受体信号通路、Toll-like受体信号通路、NF-kappa B信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等。结论:卵巢恶性生殖细胞肿瘤中存在243个可能的胚系突变位点及拷贝数变异,对拷贝数变异区域所在基因进行生物学分析发现拷贝数变异可能与卵巢恶性生殖细胞肿瘤发病相关。第二部分卵巢恶性生殖细胞肿瘤中OCT4基因拷贝数变异的检测目的:选取全外显子测序筛出的拷贝数缺失及扩增区域出现频率均大于10%的基因OCT4,通过检测其外显子区拷贝数变异,从而间接验证全外显子测序结果。方法:采用实时荧光定量PCR方法,检测62例卵巢恶性生殖细胞肿瘤外周血DNA中OCT4基因外显子拷贝数变异情况。结果:应用实时荧光定量PCR技术对OCT4基因外显子拷贝数变异进行检测,结果显示卵巢恶性生殖细胞肿瘤OCT4基因外显子拷贝数与正常对照组无明显差异,分层分析显示无性细胞瘤中拷贝数低于非无性细胞瘤。结论:应用实时荧光定量PCR技术检测OCT4基因拷贝数变异情况,未发现卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者存在OCT4基因外显子拷贝数变异。第三部分卵巢恶性生殖细胞肿瘤中OCT4基因的表达及其与临床病理特征的关系目的:研究卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者中OCT4基因的表达并分析基因表达情况与患者临床病理特征之间的关系。方法:采用免疫组织化学法检测48例卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者癌组织中OCT4的表达水平。结合患者的临床资料分析OCT4蛋白表达与卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者临床病理特征之间的关系。结果:免疫组织化学染色结果显示,11例无性细胞瘤癌组织中,OCT4阳性表达9例,阳性表达率为81.82%;37例非无性细胞瘤癌组织中,OCT4阳性表达16例,阳性表达率为43.24%。统计学分析显示,与非无性细胞瘤相比,卵巢无性细胞瘤组织中OCT4蛋白的表达水平明显增高（χ2=5.06,P<0.05）。卵巢恶性生殖细胞肿瘤组织中OCT4蛋白的表达水平与组织学类型相关,差异具有统计学意义（P<0.05）,但与患者的年龄、FIGO分期、组织学分级、肿瘤大小差异均未见统计学意义（P>0.05）。结论:与卵巢非无性细胞瘤相比较,OCT4蛋白在无性细胞瘤中高表达。OCT4在卵巢恶性生殖细胞肿瘤中的表达水平与组织学类型有关,但与患者的年龄、FIGO分期、组织学分级、肿瘤大小无关。综上所述,本研究对卵巢恶性生殖细胞肿瘤进行了全外显子测序及生物信息学分析,对测序筛出的OCT4基因拷贝数变异进行验证,并分析了OCT4蛋白在卵巢恶性生殖细胞肿瘤中的表达及其与临床病理特征的关系。本研究发现:1)卵巢恶性生殖细胞肿瘤中存在243个可能的胚系突变位点及拷贝数变异,对拷贝数变异区域所在基因进行生物学分析发现拷贝数变异可能与卵巢恶性生殖细胞肿瘤发病相关;2)本研究未发现卵巢恶性生殖细胞肿瘤患者存在OCT4基因外显子拷贝数变异;3)与卵巢非无性细胞瘤相比较,OCT4蛋白在无性细胞瘤中高表达。OCT4在卵巢恶性生殖细胞肿瘤中的表达水平与组织学类型有关,但与患者的年龄、FIGO分期、组织学分级、肿瘤大小无关。
陈晓晨[5]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中研究指明研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
张九阳[6]（2020）在《MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究》文中认为弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,抗CD20单抗联合以蒽环类为基础的多药免疫化疗方案（R-CHOP）可使超过半数患者获得完全缓解甚至治愈。但是,复发难治性DLBCL患者缺乏有效的治疗手段。DLBCL一线免疫化疗耐药的机制十分复杂,抗CD20单抗的耐药性是其中的重要内容。抗CD20单抗靶向人成熟B细胞表面CD20分子,通过抗体依赖的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用和诱导凋亡等机制发挥抗肿瘤作用。因此,肿瘤细胞CD20表达减少或缺失是抗CD20单抗耐药的主要原因。microRNA（miR）-363 来源于 miR-17-92 家族 miR-106a-363 基因簇,我们的前期研究显示miR-363在R-CHOP耐药患者中显着高表达,miR-363高表达与DLBCL患者的不良预后具有显着相关性,但miR-363高表达的机制尚不明确。使用UCSC数据库对miR-106a-363基因簇及其上游序列进行分析发现,在miR-363编码序列上游4kb处存在活化启动子相关的H3K4me3、H3K27Ac以及CpG岛等结构,提示CpG岛附近可能存在潜在的启动子调控元件。荧光基因报告试验证实序列具有启动子功能,是miR-106a-363基因簇的启动子。进一步研究显示,转录因子c-Myc能够与miR-106a-363基因簇启动子结合,调控miR-363表达。同时,c-Myc的结合能力受启动子甲基化水平的调控。综上所述,我们的研究发现miR-106a-363基因簇具有独特的启动子元件,其CpG岛甲基化水平负调控c-Myc介导的miR-363表达。以往研究认为CD20分子具有钙离子通道功能或直接调节钙离子通道活性,钙离子内流对抗CD20单抗介导的细胞凋亡十分重要。然而,有研究发现CD20缺陷的B细胞仍有钙离子内流反应,提示在B细胞中存在其他钙离子调节机制。近期报道B细胞表达一系列钙离子通道蛋白,参与调控细胞内钙离子浓度。我们的研究发现,L-型钙离子通道家族成员CACNA1C在R-CHOP耐药DLBCL患者中低表达,随后的研究显示CACNA1C通过与CD20分子相互作用稳定CD20蛋白结构,抑制CD20蛋白通过泛素化-蛋白酶体途径降解,维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性,进而影响肿瘤细胞对抗CD20单抗的敏感性。荧光素酶报告试验证实miR-363负调控CACNA1C表达,miR-363过表达导致肿瘤B细胞表面CD20表达降低,诱导抗CD20单抗耐药。多种小分子物质能够调控L-型钙离子通道蛋白的活性,影响钙离子内流和细胞内钙离子浓度,进而调节细胞凋亡过程。我们的体外细胞试验和小鼠模型研究证实CACNA1C相关的L-型钙离子通道激动剂能够促进钙离子内流,增加抗CD20单抗诱导的肿瘤细胞凋亡,CACNA1C蛋白表达未受影响,提示L-型钙离子通道激动剂具有增加抗CD20单抗疗效和克服其耐药的潜在能力,L-型钙离子通道拮抗剂具有降低抗CD20单抗疗效和诱导耐药的可能性。综上所述,本研究创新性发现miR-363高表达与DLBCL免疫化疗耐药相关,miR-106a-363基因簇启动子区高甲基化状态抑制转录因子c-Myc介导的miR-363表达;L型钙离子通道蛋白CACNA1C通过与CD20蛋白相互作用,维持CD20蛋白在DLBCL肿瘤细胞表面的表达和稳定性;miR-363通过负调控CACNA1C表达导致抗CD20单抗耐药;L-型钙离子通道调节剂能够影响抗CD20单抗介导的钙离子内流,从而影响其抗肿瘤作用,成为提高疗效的潜在方法。第一部分:弥漫大B细胞淋巴瘤中miR-363调控机制的研究目的研究miR-363受启动子甲基化调控与DLBCL不良预后的相关性及其机制。方法从UCSC数据库获取miR-106a-363基因簇上游序列,生物信息学方法预测潜在的启动子区及功能元件。在293T细胞株中使用荧光报告基因试验验证所预测启动子的功能。在DLBCL细胞株中使用Western Blotting和ChIP方法检测c-Myc表达及miR-106a-363基因簇启动子与c-Myc结合情况;RT-PCR、BSP法检测不同DLBCL细胞系DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理前后的miR-106a-363基因簇启动子甲基化水平与miR-363表达的关系。结果1.miR-106a-363基因簇具有独立的启动子结构,位于编码序列上游约4Kb处,荧光报告基因试验证实了该序列具有启动子功能,调控miR-363的转录。2.miR-106a-363基因簇启动子区CpG岛存在4个E-box结构,转录因子c-Myc通过与E-box 2区结合调控miR-363表达,该区域甲基化水平与miR-363表达呈负相关。3.使用DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨处理DLBCL细胞可降低miR-106a-363启动子E-box 2甲基化水平,上调miR-363表达。结论1.miR-106a-363基因簇具有独立的启动子序列,转录因子c-Myc结合启动子区E-box结构调控miR-106a-363基因簇的转录。2.DLBCL细胞中miR-106a-363启动子区CpG岛甲基化通过抑制c-Myc与E-box结合负调控miR-363表达。第二部分:miR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究目的研究miR-363负调控CACNA1C表达与DLBCL细胞对抗CD20单抗耐药的机制。方法以初治DLBCL患者标本为研究对象,检测R-CHOP方案耐药和敏感患者肿瘤细胞CACNA1C蛋白表达水平,分析其与患者预后的相关性。荧光素酶报告试验验证miR-363与CACNA1C表达的相关性。以DLBCL细胞株为研究对象,验证miR-363与CACNA1C表达的相关性及对抗CD20单抗敏感性的影响。构建CACNA1C稳定低表达细胞株,检测对抗CD20单抗疗效的影响。构建小鼠移植瘤模型,观察CACNA1C表达与肿瘤生长和对抗CD20单抗敏感性的关系。荧光定量PCR、免疫荧光、免疫共沉淀、Western Blot检测CANCA1C表达与CD20间的关系。使用蛋白酶体抑制剂处理CACNA1C低表达细胞株,检测CD20蛋白变化。使用L-型钙离子通道激动剂Bay K8644和抑制剂尼莫地平处理OCI-Ly3、OCI-Ly7、OCI-Ly8,流式细胞术检测细胞凋亡,使用DLBCL患者组织构建小鼠PDX模型,观察L-型钙离子通道调节剂对抗CD20单抗敏感性的影响。构建miR-363过表达和敲除的DLBCL细胞株,体外验证miR-363对CACNA1C的调控和对DLBCL细胞的影响。结果1.CACNA1C低表达与R-CHOP方案耐药和不良生存相关,是R-CHOP方案的独立不良预后因素,但是,CHOP方案治疗的DLBCL患者中CACNA1C表达与预后无显着相关性。CACNA1C在正常B细胞发育不同阶段表达存在差异。2.CACNA1C低表达在体外抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡,在小鼠移植瘤模型中抑制抗CD20单抗介导的肿瘤消减。3.抗CD20单抗处理后B细胞表面CACNA1C和CD20存在相互作用,这种蛋白互作抑制CD20降解,增强CD20蛋白稳定性。4.体外和小鼠模型研究证实L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控CACNA1C功能,影响抗CD20单抗介导的钙离子内流,调节DLBCL细胞对抗CD20单抗的敏感性。5.miR-363负调控CACNA1C表达并引起CD20蛋白表达下降,抑制抗CD20单抗介导的DLBCL细胞凋亡。结论1.miR-363负调控CACNA1C表达,增加CD20蛋白通过蛋白酶体途径降解,介导抗CD20单抗耐药。2.靶向CACNA1C相关的L-型钙离子通道蛋白调节剂通过调控钙离子内流影响抗CD20单抗的疗效。
林健振[7]（2020）在《原发性肝胆肿瘤的基因组学分析及临床转化研究》文中研究指明原发性肝胆肿瘤是指发生于肝细胞、肝内胆管、肝外胆道及胆囊的恶性占位性病变。该系统肿瘤的侵袭性高,首诊时外科可切除率低,患者的生存期短,临床预后差。多种辅助抗癌手段带给进展期患者的生存获益有限,因此亟需利用临床特征和病理学信息对患者进行精细分层并精准施治以提高临床获益率。近年来,基因组检测技术揭示了肝胆肿瘤的分子特征,从而极大丰富了肝胆肿瘤患者的分层信息维度。然而,如何将肿瘤基因组的分子病理信息有效融入实际的临床诊疗环节仍是主要瓶颈问题,且我国原发性肝胆恶性肿瘤患者的病因学及流行病学特征与西方国家人群有较大区别,故需要进行更多的临床前探索和临床转化运用以明确我国肝胆肿瘤患者的基因组特征和精准治疗依据。由此,本研究使用全外显子测序和靶向捕获深度测序相结合的基因组检测手段,对肝胆恶性肿瘤患者进行基因突变筛查,并将肿瘤突变信息与临床背景、组织病理特征、临床治疗结局和生存预后相关联,寻找肿瘤基因组的临床转化价值。本研究还初步探索了基于基因突变特征匹配靶向药物的可行性和实际疗效。本论文包含如下三个部分研究内容:（1）第一部分研究在357例原发性肝癌患者中详细描绘了 DNA损伤修复（DDR）相关基因的突变情况和突变者的基因组及临床-病理特征,发现其中25.8%的患者为DDR突变型肝癌,且15例患者为DDR胚系变异,证实BRCA2可为肝内胆管癌患者的家系遗传易感基因。原发性肝癌中最常见的DDR突变基因为ATM（5%）和BRCA（4.8%）,而DDR突变可导致肿瘤突变负荷显着增高。在DDR突变型肝癌中,26.1%的患者可通过基因组筛查找到相应的靶向药物,本研究对其中8例BRCA突变型患者使用了奥拉帕尼的临床治疗,发现BRCA2胚系、截短突变型患者能够实现肿瘤的客观缓解。（2）第二部分研究评估了 158例肝内胆管癌患者的肿瘤基因组非整倍体负荷（TAB）,发现染色质修饰基因PBRM1和BAP1的突变与TAB升高有关。存在26%的患者TAB为0（TAB-negative）,而这部分患者的肿瘤免疫微环境中固有免疫成分更高,巨噬细胞显着增多,倾向于免疫抑制性肿瘤。生存分析进一步发现TAB-negative的肝内胆管癌患者的术后复发时间最短,术后总生存期最差,而高TAB（>5）的患者对以吉西他滨为基础的全身化疗的客观应答率和无进展生存期都有显着优势。（3）第三部分研究对803例中国胆道肿瘤患者的基因组进行了系统分析,发现胆道肿瘤的基因突变具有较高的个体间异质性,除了 TP53（51%）和KRAS（23%）外,每个肿瘤相关突变基因均仅占人群的5-15%,并根据解剖学部位、临床分期和肝炎感染史等病因差异而有所不同。通过识别肿瘤的基因突变特征,构建了区分肝细胞肝癌和肝内胆管癌的分子诊断模型,并且能够辅助判断混合型肝癌的表型倾向和生存期。研究进一步确定了 KRAS、TP53突变和7q31.2染色体扩增是胆道肿瘤患者生存期的不利风险因素,并鉴定出7q31.2上的编码基因CAPZA2在胆管癌中具有促癌表型。最后,该部分研究基于循证医学证据,提出了 19个针对胆道肿瘤的可治疗靶点,并依此证据在46例患者中进行了“伞式”设计的临床转化治疗,总体达到了 26.1%的客观缓解率和5个月的中位无进展生存期。综上,本研究主要在原发性肝胆恶性肿瘤患者队列中鉴定了肿瘤相关基因和DNA损伤修复基因的突变,量化了肿瘤非整倍体性,描绘了中国人群肝胆肿瘤基因组的突变特征。在此基础上,本研究基于循证医学的支持和临床治疗的实践,初步探索了利用基因组进行临床转化运用的路径,提供了面向肝胆肿瘤进行精细分层、精准施治模式的参考依据。
张长凯[8]（2019）在《EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究》文中研究表明目的通过检测淋巴瘤及骨髓异常增生综合征（MDS）病人骨髓细胞中EB病毒（EBV）DNA（EBV-DNA）的拷贝数,以探讨EBV感染与淋巴瘤及MDS的发生、发展及染色体改变的相关性,同时探讨EBV感染在淋巴瘤的免疫分型及淋巴瘤与MDS病人预后判断中的价值。方法采集198例淋巴瘤及MDS病人的骨髓标本作为实验病例组,其中包括霍奇金淋巴瘤（HL）病人14例,非霍奇金淋巴瘤（NHL）病人136例,骨髓异常增生综合征（MDS）病人48例,同时采集37例健康者（骨髓象正常且无任何血液系统疾病）的骨髓作为对照组。运用苯酚-氯仿-异戊醇法提取骨髓液中单个核细胞中的DNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术检测所提取的全部样本骨髓液细胞中的EBV-DNA;采取骨髓细胞短期培养法制备染色体标本,用R显带技术分析染色体核型;采用流式细胞技术对NHL病人进行免疫表型分析,探讨T-NHL和B-NHL与EBV感染的相关性。并对部分病人进行了临床随访,以进一步探讨EBV感染与淋巴瘤、MDS病人的复发及死亡的影响。结果198例淋巴瘤及MDS病人中有76例检测到EBV-DNA,总体阳性率38.4%,而对照组仅中有2例（5.4%）检测到EBV-DNA,病例组中EBV-DNA的阳性率明显高于对照组（χ2=13.8,p<0.01）。HL、NHL和MDS病人EBV-DNA的阳性率分别为64.3%（9/14）、36.8%（50/136）和35.4%（17/48）,均显着高于对照组（χ2=17.4,12.1,10.7,p<0.01）,其中HL组EBV-DNA的阳性率高于NHL（χ2=4.03,p<0.05）,但HL与MDS,NHL与MDS间EBV-DNA的阳性率无差异（χ2=3.71,0.03,p>0.05）。结合流式细胞仪的分型结果,110例B-NHL中40例检测到EBV-DNA,阳性率为36.4%（40/110）;26例T-NHL中10检测到EBV-DNA,其阳性率为38.5%（10/26）,B-NHL与T-NHL病人间EBV-DNA的阳性率没有差异（χ2=0.04,p>0.05）。染色体R显带核型分析显示,20例EBV-DNA阳性患者（NHL、MDS各10例）检测到染色体核型异常,染色体异常的检出率为26.3%（20/76）,而在EBV-DNA阴性的患者中有27例（NHL 12例、MDS 15例）检测到染色体核型的异常,染色体异常的检出率为22.1%（27/122）,EBV感染与染色体异常无显着相关性（χ2=0.45,p>0.05）。临床随访显示,2年内EBV阳性病人和EBV阴性病人的复发率和死亡率分别为56.1%（23/41）、31.7%（20/63）和24.4%（10/41）、3.2%（2/63）（p<0.05）。与EBV阴性病人相比,EBV阳性病人具有更高的复发率和死亡率。在进展为急性白血病的11例MDS中有8例（72.7%）为EBV阳性,有3例（27.3%）为EBV阴性,MDS中EBV阳性病人的转白率明显高于EBV阴性病人（χ2=6.70,p<0.05）,表明MDS转白与EBV感染之间存在一定的相关性。结论EBV感染与淋巴瘤、MDS的发生及病情进展有关,但与染色体改变及HL的免疫分型没有相关性;EBV感染与淋巴瘤、MDS病人的预后有关,EBV-DNA阳性病人有较高的复发率和死亡率,预后不佳。
林晓骥[9]（2019）在《miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究》文中指出研究背景和目的:miRNAs是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA,通过靶基因mRNA裂解或序列特异性翻译抑制来发挥重要作用,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学过程。目前很多研究结果揭示在许多肿瘤中存在着miRNAs的调控异常,从而影响着肿瘤的发生发展、转移和浸润。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的类型。CHOP方案是目前被证实的治疗DLBCL的最经典治疗方案,然而超过50%的患者仍会出现耐药或复发的现象。现研究发现miRNAs与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药性存在密切相关。miR-148b位于人染色体12q13.13上,在结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多种肿瘤组织中普遍存在表达异常。多个研究表明,上调MiR-148b可以逆转非小细胞肺癌细胞株对顺铂的耐药性,而miR-148b的上调同样可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株对放疗的敏感性。然而,miR-148b在DLBCL耐药中的作用还没有得到研究。因此,本研究旨在研究miR-148b在DLBCL的耐药中的潜在作用和机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。实验方法:1.收集DLBCL患者的新鲜肿瘤组织,根据CHOP方案治疗反应情况分为CHOP敏感组和CHOP耐药组,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b表达情况。2.采用低浓度药物浓度递增的方法建立人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP,采用CCK-8方法比较不同浓度CHOP对CRL2631细胞和耐药株CRL2631/CHOP细胞的活性影响,以及采用Western blot方法检测MDR-1蛋白水平在CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的表达情况。3.收集CRL2631细胞和CRL2631/CHOP细胞的总RNA,实时荧光定量PCR 比较两组miR-148b的表达情况。4.根据生物信息学预测软件,寻找miR-148b潜在的靶基因。采用经典的双荧光素酶报告基因实验,将野生型/突变型Ezrin 3’ UTR荧光素酶报告载体和miR-148b inhibitor/miR-148b mimic共转染CRL2631细胞,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒,分别检测各组细胞荧光素酶和海肾荧光素酶信号,并以海肾荧光素酶活性作为对照,计算荧光素酶相对活性。5.分别将miR-148b inhibitor和miR-148b mimic转染CRL2631细胞后,采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Ezrin mRNA和蛋白的表达情况。6.通过实时荧光定量PCR和Western blot分别比较DLBCL患者CHOP敏感组与CHOP耐药组两组和CRL2631细胞与CRL2631/CHOP细胞两组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平,并分析DLBCL患者的Ezrin mRNA和miR-148b表达的相关性。7.分别将 miR-148b inhibitor、NC、si-Ezrin 和 si-control 转染至 CRL2631 细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631细胞的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。8.分别将 miR-148b mimic、pre-NC、pcDNA-Ezrin 和 pcDNA 转染至 CRL2631/CHOP细胞,采用CCK-8方法检测不同浓度CHOP对各组CRL2631/CHOP的活性影响,并采用Western blot检测各组Ezrin和MDR-1的表达情况。9.分别将agomir-148b与agomir-NC转染CRL2631/CHOP细胞,然后在裸鼠背部皮下接种成瘤,采用CHOP方案进行处理后观察比较两组皮下移植瘤生长情况;取下肿瘤组织,采用实时荧光定量PCR检测两组的miR-148b表达情况;采用实时荧光定量PCR和Western blot检测两组Ezrin的mRNA和蛋白表达情况。结果:1.诱导产生了人DLBCL耐药细胞株CRL2631/CHOP;相比较CRL2631细胞,CRL2631/CHOP细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显着提高。2.DLBCL患者CHOP敏感组肿瘤组织的miR-148b表达水平显着高于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的miR-148b表达水平显着低于CRL2631细胞。3.通过生物信息学软件（RAID v2.0）预测发现,Ezrin是miR-148b的直接靶基因。相对于对照组,miR-148b mimic+野生型Ezrin 3’UTR载体（WT）组荧光素酶活性明显降低,而miR-148bmimic+突变型Ezrin 3’UTR载体（MUT）组荧光素酶活性无明显改变。相反,在miR-148b inhibitor+WT组,荧光素酶活性与对照组显着提升,而miR-148b inhibitor+MUT组的荧光素酶活性改变与对照组比较并无显着差异。4.上调miR-148b的表达后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和Ezrin蛋白的表达量均较对照组显着下降。另外,与对照组相比,miR-148b的表达下调后,CRL2631细胞的Ezrin mRNA和蛋白表达量呈显着提升。5.DLBCL患者CHOP敏感组的Ezrin mRNA和蛋白表达水平显着低于CHOP耐药组,而CRL2631/CHOP细胞的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显着高于CRL2631细胞;进一步发现,DLBCL患者中,miR-148b与Ezrin mRNA表达存在直线负性相关关系。6.miR-148b inhibitor转染CRL2631细胞后,Ezrin的蛋白表达上调,细胞对CHOP的敏感性下降,IC50值明显升高,MDR-1蛋白水平表达也显着提高;共同转染miR-148b inhibitor 和 si-Ezrin 后,miR-148b inhibitor+si-Ezrin组 CRL2631 细胞的 Ezrin蛋白表达较miR-148b inhibitor组明显降低,细胞对CHOP敏感性显着提升,MDR-1蛋白水平表达下降。7.miR-148b mimic转染CRL2631/CHOP细胞后,Ezrin的蛋白表达下调,细胞对CHOP的敏感性增强,IC50值明显下降,MDR-1蛋白表达水平也显着下降;而共同转染 miR-148b mimic 和 PcDNA-Ezrin 后,miR-148b mimic+PcDNA-Ezrin 组CRL2631/CHOP细胞的Ezrin蛋白表达较miR-148b mimic组明显上调,细胞对CHOP敏感性显着下降,MDR-1蛋白水平表达明显上升。8.裸鼠在CHOP处理后,agomir-148b组皮下移植瘤体积较agomir-NC组显着减小;另外,而agomir-148b组的miR-148b表达水平显着高于agomir-NC组,而agomir-148b组的Ezrin mRNA和蛋白均表达水平显着低于agomir-NC组。结论:1.miR-148b在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现低表达。2.Ezrin在耐药性DLBCL患者及CRL2631/CHOP细胞中呈现高表达3.Ezrin为miR-148b的靶基因4.miR-148b通过靶向调控Ezrin调节DLBCL细胞对CHOP的耐药性6.本研究结果有助于探索DLBCL细胞耐药性中的关键作用的分子及其调控机制,为逆转耐药和靶向治疗提供新的理论思路。
陈钶[10]（2019）在《1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究》文中研究表明原发性肝细胞性肝癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤之一,尤其在中国,每年无论发病人数或死亡人数均占了全球肝癌患者总数的一半以上。肝癌是一种由多种危险因素导致各种分子机制异常改变的复杂疾病。虽然以手术为主的综合治疗取得了一定的进步,然而肝癌患者总体预后仍然较差。寻找能够用于肝癌早期诊断和治疗的靶点是改善患者预后的重要方法。NCoA6是诸多核激素受体和重要转录因子基因活化所必须的一种多功能的共激活因子,对机体正常生长、发育、创伤愈合以及维持能量平衡等发挥重要作用。有研究发现NCoA6在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤等众多恶性肿瘤中表达上调,但NCoA6在肝细胞性肝癌中的表达情况和具体作用仍不明确。因此本文第一部分通过检测NCoA6在肝癌组织和细胞株中的表达情况,结合一系列体内外实验,详细阐述NCoA6在肝癌中的表达,并进一步探索该基因参与肝癌发生发展的生物学机制。如前所述,手术仍是目前肝癌综合治疗的最重要组成部分。但传统的开腹手术在治疗疾病的同时也造成了巨大的创伤。以腹腔镜技术为代表的“微创外科”被认为是21世纪外科发展的两大方向之一。近些年来腹腔镜肝脏手术发展迅猛。但肝细胞性肝癌患者往往合并有肝硬化、肝功能不全,这类患者易出血、对手术的耐受性差。若肿瘤位于右肝需行右半肝切除,对这类患者在腹腔镜下完成右半肝切除手术难度大、风险高,因而相关的研究报道甚少。因此本文第二部分回顾性分析了本中心因肝细胞性肝癌行右半肝切除的病例,将病例分为腹腔镜和开腹右半肝切除组,并使用倾向性指数配对的方法,对比分析两组间围手术期临床病理指标、术后恢复及并发症情况、肿瘤远期根治效果等,以探讨腹腔镜右半肝切除治疗肝细胞性肝癌的手术经验、安全性、有效性和应用价值。第一部分:核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究第一节:NCoA6在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征之间的相关性分析方法:对Oncomine和TGCA等数据库进行检索,运用生物信息学方法分析NCoA6在肝细胞肝癌中的表达情况以及与预后的相关性。运用PCR、Westernblot和免疫组织化学技术检测NCoA6在肝癌细胞株以及临床肝癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,分析NCoA6与患者临床病理特征及预后的相关性。结果:生物学分析发现NCoA6在肝细胞肝癌中显着升高,并且与患者预后有显着相关性。PCR和Western blot结果证实NCoA6在肝癌细胞株和临床肝癌组织中呈高表达。对103例肝癌组织进行免疫组化分析,并结合肝癌患者的临床病理特征,我们发现NCoA6的高表达与患者的肝癌肿瘤大小密切相关（p=0.004）。结合患者的随访数据,进行Kaplan-Meier生存分析,结果发现NCoA6表达高的患者术后5年生存率显着低于表达较低的患者（p=0.01）。COX多因素分析发现,NCoA6为肝癌患者总生存期和无瘤生存期的独立危险因素（p<0.05）。结论:NCoA6在肝癌细胞系以及患者肿瘤组织中呈异常高表达,并且与患者的预后存在明显相关性。第二节:NCoA6对肝细胞肝癌生物学行为的调控作用方法:通过体外转染小干扰RNA和感染慢病毒构建NCoA6敲减肝癌细胞株,通过CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、EdU、流式细胞周期实验、流式细胞凋亡试验、Transwell细胞迁移/侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验,并结合Western blot相关蛋白检测结果,观察和分析NCoA6对肝癌细胞周期、凋亡、增殖、迁移等能力的影响。结果:敲减NCoA6能明显抑制肝癌细胞株Huh7和HCC-LM3的增殖,发生细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,并改变细胞周期和凋亡相关蛋白,但对细胞侵袭、迁移能力无影响,不改变EMT特征蛋白的表达。裸鼠肝癌移植瘤实验发现敲减NCoA6能显着抑制肿瘤的生长。结论:NCoA6参与调控肝癌细胞体外增殖、细胞周期、凋亡和体内成瘤能力,但对癌细胞的迁移和侵袭能力无明显影响。第三节:NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞增殖方法:利用基因表达谱芯片技术筛选NCoA6调控的下游靶基因。经qRCR验证基因芯片结果可靠后,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能和通路。根据富集分析结果并结合文献挑选可能受调控的信号通路,采用Western blot检测这些通路的相关蛋白表达。结果:根据富集分析结果并结合文献,我们发现NCoA6可能通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路调节肝癌的发生发展。Western blot检测上述两条通路相关蛋白,结果发现敲减NCoA6可以抑制这些通路的活性。结论:NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞周期进程,并抑制肝癌细胞凋亡。第二部分:腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究方法:回顾性分析医院普外科于2007年5月至2019年2月因肝细胞性肝癌行标准右半肝切除的病例,并分为腹腔镜组和开腹组。基于年龄、性别、术前治疗、肿瘤大小和个数的1:1倾向性得分用来配对两组以减少选择偏倚的影响。分别对比两组间在配对前和配对后的临床病理学指标、术后恢复情况以及远期预后等。结果:共131例因肝细胞肝癌行右半肝切除的患者。其中腹腔镜组51例,开腹组80例。腹腔镜组中转开腹8例,中转开腹率15.7%;总体术后并发症率19.6%,无围手术期死亡病例。经倾向性得分配对后,两组各44例纳入本研究。两组间总手术时间差异无统计学意义（248.4±88.7 231.6±44.4 min,p=0.26）。但与开腹组相比,腹腔镜组术中出血显着减少[300（100-1200）500（200-2000）mL,p<0.01]。虽然腹腔镜组术后并发症率低于开腹组,但差异未达到统计学意义（18.2 29.5%,p=0.21）。腹腔镜组中位随访17（2-68）个月,开腹组中位随访15（3-103）个月。两组间3年无瘤生存率和总生存率的差异均无统计学意义。结论:腹腔镜右半肝切除治疗肝细胞性肝癌在手术安全性和肿瘤根治性上可以取得与开腹手术相似的效果。腹腔镜右半肝切除可以减少术中出血,还有可能减少术后并发症,缩短住院时间。本研究的结论需要在将来被设计严谨的更高质量对照研究进一步证实。
二、1q12-22染色体位点在B细胞性NHL基因组中的不稳定性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、1q12-22染色体位点在B细胞性NHL基因组中的不稳定性（论文提纲范文）
（1）基于PCR的HERV-K（HML-2）靶向富集测序技术的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 人内源性逆转录病毒(Human Endogenous Retroviruses,HERVs) |
| 1.2 HERV-K(HML-2)的结构 |
| 1.3 已知HERV-K(HML-2)位点信息汇总 |
| 1.3.1 所有已报道的HERV-K(HML-2)位点信息 |
| 1.3.2 人类特有的HERV-K(HML-2)位点 |
| 1.3.3 具有插入多态性的HERV-K(HML-2)位点 |
| 1.3.4 邻近基因编码区域的HERV-K(HML-2)位点 |
| 1.4 HERV-K(HML-2)在疾病中存在的异常现象 |
| 1.4.1 HERV-K(HML-2)相关病毒蛋白的异常表达 |
| 1.4.2 宿主针对HERV-K(HML-2)病毒蛋白的异常的体液和细胞免疫应答 |
| 1.4.3 类病毒颗粒的形成 |
| 1.4.4 其他异常现象 |
| 1.5 HERV-K(HML-2)潜在的致病机制 |
| 1.5.1 HERV-K(HML-2)病毒蛋白的致病机制 |
| 1.5.2 LTR对宿主基因组的异常调控机制 |
| 1.5.3 HERV-K(HML-2)位点的插入多态性 |
| 1.5.4 HERV-K(HML-2)位点的从头插入 |
| 1.6 用于HERV-K(HML-2)位点检测的方法 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第2章 一种基于PCR的靶向HERV-K(HML-2)位点的高通量测序方法的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 全基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 用于文库构建的接头及引物序列设计 |
| 2.1.4 GAPS接头退火 |
| 2.1.5 全基因组DNA片段化 |
| 2.1.6 片段化DNA末端修复加A尾及GAPS接头连接 |
| 2.1.7 GAPS接头连接后纯化 |
| 2.1.8 靶向富集PCR |
| 2.1.9 扩增后纯化 |
| 2.1.10 纯化后PCR产物末端修复加A及 Illumina接头连接 |
| 2.1.11 Illumina测序接头连接后纯化 |
| 2.1.12 文库片段选择 |
| 2.1.13 文库混合及测序 |
| 2.1.14 测序原始数据的过滤及HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 2.1.15 利用PTESHK技术可检测HERV-K(HML-2)位点数的统计 |
| 2.1.16 PTESHK技术重复性的检测 |
| 2.1.17 系统进化分析 |
| 2.1.18 多态性插入位点分析及验证 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 PTESHK方法的构建及优化 |
| 2.2.2 PTESHK对 HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 2.2.3 PTESHK对 HERV-K(HML-2)位点的检测的特性评估 |
| 2.2.4 PTESHK检测HERV-K(HML-2)位点的特征 |
| 2.2.5 利用PTESHK技术对多态性插入位点的检测 |
| 2.3 结论 |
| 第3章 利用PTESHK对前列腺癌细胞系中HERV-K(HML-2)位点的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 前列腺癌细胞系 |
| 3.1.2 RPMI1640 完全培养基的配制 |
| 3.1.3 DMEM(高糖)完全培养基的配制 |
| 3.1.4 细胞复苏与接种 |
| 3.1.5 细胞消化及DNA提取 |
| 3.1.6 PTESHK文库构建及测序 |
| 3.1.7 测序原始数据的过滤及HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 3.1.8 多态性插入位点分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 PTESHK对不同前列腺癌细胞系中HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 3.2.2 利用PTESHK对4 种前列腺癌细胞系中多态性插入位点的检测 |
| 3.2.3 利用PTESHK技术可检测的重复性好的HERV-K(HML-2)位点的筛选 |
| 3.3 结论 |
| 第4章 同卵双胎基因组HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 同卵双胎样本DNA |
| 4.1.2 样本DNA纯化及PTESHK文库构建测序 |
| 4.1.3 测序原始数据的过滤及HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 4.1.4 多态性插入HERV-K(HML-2)位点的分析与验证 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 无实验重复样本间的多态性插入HERV-K(HML-2)位点的分析 |
| 4.2.2 同卵双胎样本间的差异HERV-K(HML-2)位点的分析 |
| 4.3 结论 |
| 第5章 不同种族群体间多态性插入HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 不同种族样本 |
| 5.1.2 PTESHK文库构建及测序 |
| 5.1.3 测序原始数据的过滤及HERV-K(HML-2)位点的分析 |
| 5.1.4 多态性插入HERV-K(HML-2)位点的分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 PTESHK对中国人群和意大利人群中HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 5.2.2 中国群体和意大利群体中多态性插入HERV-K(HML-2)位点的检测 |
| 5.3 结论 |
| 第6章 总结 |
| 第7章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| REFERENCES |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文情况 |
（2）伴有额外染色体异常的Ph+慢性粒细胞性白血病患者基因组改变的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:aCGH检测Ph+慢性粒细胞白血病患者发生额外基因拷贝数变异的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 染色体核型分析 |
| 2.3.2 荧光原位杂交 |
| 2.3.3 DNA提取 |
| 2.3.4 微阵列比较基因组杂交技术 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:全外显子组测序检测Ph+慢性粒细胞白血病患者发生额外染色体异常相关的分子遗传学改变 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 全外显子组测序 |
| 2.3.1 样本DNA的准备 |
| 2.3.2 文库制备 |
| 2.3.3 杂交及捕获 |
| 2.3.4 捕获后加标签,样本测序准备 |
| 2.3.5 全外显子组上机测序 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.4.1 原始序列数据 |
| 2.4.2 序列过滤统计 |
| 2.4.3 序列对比统计 |
| 2.4.4 质量控制 |
| 2.4.5 覆盖度统计 |
| 2.4.6 体细胞变异筛选 |
| 2.4.7 体细胞变异注释 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 患者的临床资料和常规细胞遗传学检测结果 |
| 3.2 全外显子组测序结果 |
| 3.2.1 序列过滤统计结果 |
| 3.2.2 序列比对统计结果 |
| 3.2.3 质量控制统计结果 |
| 3.2.4 覆盖度统计结果 |
| 3.2.5 体细胞变异的筛选和注释 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 基于二代测序的慢性粒细胞性白血病基因变异的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变（论文提纲范文）
| 第一部分通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常:KMT2D及MYD88突变 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 样本与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 套细胞淋巴瘤分子发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 缩略词表 |
| 附件2 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）卵巢恶性生殖细胞肿瘤遗传变异基因的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 卵巢恶性生殖细胞肿瘤全外显子胚系突变检测及生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 卵巢恶性生殖细胞肿瘤中OCT4基因拷贝数变异的检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 卵巢恶性生殖细胞肿瘤中OCT4基因的表达及其与临床病理特征的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述卵巢恶性生殖细胞肿瘤研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 弥漫大B细胞淋巴瘤中MIR-363调控机制的研究 |
| 前言 |
| 1 主要试剂及仪器 |
| 2 主要实验步骤 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 MIR-363介导弥漫大B细胞淋巴瘤耐药机制的研究 |
| 前言 |
| 1 主要试剂及仪器 |
| 2 主要实验步骤 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 表观遗传调控因子和钙离子通道与肿瘤发生和耐药相关机制的研究进展 |
| 1 表观遗传调控因子与肿瘤发生和耐药 |
| 2 钙离子通道与肿瘤的发生和耐药 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 在学期间发表文章 |
| 在学期间获得的奖励 |
| 课题及成果 |
| 致谢 |
（7）原发性肝胆肿瘤的基因组学分析及临床转化研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表(Abbreviations) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 原发性肝癌的DNA修复基因突变谱及临床转化应用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.病例资料 |
| 2.样本的采集、质控及处理 |
| 3.CSYS平台文库构建及测序 |
| 4.生物信息分析 |
| 5.定义DDR基因集 |
| 6.可作用突变靶点的定义及分类 |
| 7.临床治疗及评效标准 |
| 8.统计分析 |
| 结果 |
| 1.研究队列的临床-病理特征 |
| 2.PLC的DDR基因突变频谱 |
| 3.DDR基因突变与TMB之间的相关性分析 |
| 4.BRCA1/2突变型PLC患者的临床转化靶向治疗 |
| 5.DDR突变的PLC患者可行临床转化治疗的潜在人群及靶点特征 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝内胆管细胞癌的染色体不稳定性及临床相关性分析 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.病例来源及数据构成 |
| 2.组织样本的DNA/RNA提取及质控 |
| 3.高通量二代测序 |
| 4.获取已公开发表数据 |
| 5.WES数据的生物信息学分析 |
| 6.RNAseq数据分析 |
| 7.GSE33327数据集分析 |
| 8.Anderson分子分型和Sia分子分型 |
| 9.免疫组化分析 |
| 10.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.研究队列 |
| 2.肿瘤组织中的基因组拷贝数变异及非整倍性 |
| 3.TAB和TMB的相关性分析 |
| 4.TAB分组间存在差异的肿瘤基因组特征 |
| 5.TAB分型相关的基因表达及分子表型特征 |
| 6.TAB分型间不同的TME特征 |
| 7.比较TAB分型与已有ICC分子分型 |
| 8.TAB分型是ICC患者术后生存期的独立风险因素 |
| 9.TAB分型与进展期ICC患者的辅助化疗疗效结局相关性分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 胆道恶性肿瘤的基因组突变谱及临床转化应用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.病例来源及队列构成 |
| 2.样本的DNA提取 |
| 3.基因组外显子高通量测序 |
| 4.测序数据处理及体细胞突变鉴定 |
| 5.深度学习构建分子模型鉴别诊断HCC-ICC |
| 6.定义SWI/SNF复合物、错配修复(MMR)及DDR基因 |
| 7.CAPZA2的细胞功能实验 |
| 8.定义可作为转化治疗的基因突变靶点(Potentially Actionable Targets,PATs) |
| 9.临床治疗方案制定及疗效评价 |
| 10.统计分析 |
| 结果 |
| 1.研究样本及临床-病理背景特征 |
| 2.识别BTC中显着突变的肿瘤驱动基因 |
| 3.常见的拷贝数变异(somatic copy number alterations,SCNAs) |
| 4.构建BTC的十大肿瘤信号通路突变全景图 |
| 5.一些特定基因集的变异情况: SWI/SNF复合物基因和错配修复基因的体细胞突变、DNA损伤修复基因的胚系突变 |
| 6.构建基于碱基突变特征的分子诊断模型用于原发性肝癌病理亚型区分 |
| 7.鉴定生存预后相关的基因组生物标志物 |
| 8.染色体片段7q31.2上CAPZA2是ICC的促癌基因 |
| 9.识别BTC基因组中的潜在可治疗靶点 |
| 10.基于“伞式”模式下的突变-靶点-治疗的临床转化应用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一、“肝胆恶性肿瘤的个体化精准诊断及治疗研究”的研究人群标准 |
| 附录二、CSYS靶向捕获深度测序平台检测的目标基因集 |
| 附录三、鉴定原发性肝细胞肝癌突变来源的可作用靶点及对比证据级别强度 |
| 附录四、基于158例肝内胆管癌的全外显子测序数据筛选出的显着突变基因 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（8）EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA提取及检测 |
| 2.1.1 骨髓细胞基因组DNA提取 |
| 2.1.2 DNA浓度和纯度检测 |
| 2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR) |
| 2.2.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.2 PCR反应结果解读 |
| 2.3 细胞免疫学分型 |
| 2.4 制备染色体与R显带 |
| 2.4.1 染色体的制备 |
| 2.4.2 染色体R显带 |
| 2.4.3 染色体核型分析 |
| 2.5 临床随访 |
| 2.6 数据处理方法 |
| 结果 |
| 1 EBV在淋巴瘤及MDS中的表达 |
| 2 非霍奇金淋巴瘤(NHL)的免疫表型与 EBV |
| 3 EBV感染与核型异常的相关性 |
| 4 EBV感染与MDS的进展 |
| 5 EBV与其它临床及实验指标的相关性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNAs在血液系统恶性肿瘤发生及治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略 |
| 博士期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（10）1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一部分核受体共激活因子NC〇A6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究 |
| 绪论 |
| 第一节 NCoA6在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征之间的相关性分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二节 NCoA6对肝细胞肝癌生物学行为的调控作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三节 NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞增殖 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
四、1q12-22染色体位点在B细胞性NHL基因组中的不稳定性（论文参考文献）
- [1]基于PCR的HERV-K（HML-2）靶向富集测序技术的建立及应用[D]. 薛蓓. 汕头大学, 2021(01)
- [2]伴有额外染色体异常的Ph+慢性粒细胞性白血病患者基因组改变的研究[D]. 刘梦. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变[D]. 阎禹廷. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]卵巢恶性生殖细胞肿瘤遗传变异基因的筛选[D]. 陈娟. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [6]MicroRNA363与弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关分子机制的研究[D]. 张九阳. 郑州大学, 2020(02)
- [7]原发性肝胆肿瘤的基因组学分析及临床转化研究[D]. 林健振. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]EB病毒感染与淋巴瘤及骨髓增生异常综合征的相关性研究[D]. 张长凯. 青岛大学, 2019(03)
- [9]miR-148b通过Ezrin蛋白调控弥漫性大B细胞淋巴瘤药物敏感性的研究[D]. 林晓骥. 苏州大学, 2019(08)
- [10]1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究[D]. 陈钶. 浙江大学, 2019(03)